Sannino, Sabrina (2016) Analisi funzionale delle γ-glutammil transpeptidasi di insetto. [Tesi di dottorato]

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Tipologia del documento:	Tesi di dottorato
Lingua:	Italiano
Titolo:	Analisi funzionale delle γ-glutammil transpeptidasi di insetto
Autori:	Autore Email Sannino, Sabrina sabrina.sannino@ibbr.cnr.it
Data:	31 Marzo 2016
Numero di pagine:	127
Istituzione:	Università degli Studi di Napoli Federico II
Dipartimento:	Agraria
Scuola di dottorato:	Biotecnologie
Dottorato:	Insect science and biotechnology
Ciclo di dottorato:	28
Coordinatore del Corso di dottorato:	nome email Pennacchio, Francesco f.pennacchio@unina.it
Tutor:	nome email Gigliotti, Silvia [non definito]
Data:	31 Marzo 2016
Numero di pagine:	127
Parole chiave:	Aphidius ervi, Drosophila melanogaster, GGT
Settori scientifico-disciplinari del MIUR:	Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/11 - Entomologia generale e applicata Area 05 - Scienze biologiche > BIO/11 - Biologia molecolare Area 05 - Scienze biologiche > BIO/18 - Genetica
Depositato il:	14 Apr 2016 10:02
Ultima modifica:	15 Mag 2021 01:00
URI:	http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/11130

Abstract

L'obiettivo del mio progetto di dottorato è stato la caratterizzazione dei meccanismi molecolari utilizzati dalla proteina AeGGT1, una γ-glutammil transpeptidasi presente nel veleno del parassitoide Aphidius ervi, per svolgere le proprie funzioni. Quest'obiettivo è stato perseguito attraverso la messa a punto e l'analisi di un sistema di espressione eterologa nell'insetto modello Drosophila melanogaster. Le γ-glutammil transpeptidasi (GGT) sono enzimi chiave nel metabolismo del glutatione (GSH), un importante antiossidante cellulare. Il loro coinvolgimento in molteplici aspetti della fisiopatologia umana ha promosso un'intensa attività di ricerca nei mammiferi. Al contrario, le informazioni disponibili sulle funzioni delle GGT negli insetti sono molto limitate. La proteina AeGGT1 è una proteina eterodimerica secreta. Essa si origina mediante scissione autocatalitica da un singolo precursore e viene iniettata dalla femmina del parassitoide Aphidius ervi nel corpo dell'afide Acyrthosiphon pisum al momento dell'ovideposizione. Organo bersaglio di questa proteina, capace di produrre effetti devastanti sulle attività riproduttive dell'insetto ospite, sono gli ovari, all'interno dei quali essa provoca fenomeni apoptotici che interessano sia le cellule germinali, sia gli embrioni in via di sviluppo. Per allestire un sistema di espressione della proteina AeGGT1 in Drosophila, ho disegnato e costruito due diversi tipi di geni ricombinanti. Ciascun gene codifica per una proteina di fusione destinata a raggiungere l?ambiente extracellulare. Una di esse, la proteina AeGGT1V5His, è stata progettata come proteina solubile, mentre l?altra proteina, AeGGT1MLGPI, è stata fornita dei segnali necessari per ricevere l'aggiunta di un'ancora di glicosilfosfatidilinositolo durante il passaggio attraverso le cisterne del Golgi. Entrambe le proteine possono essere riconosciute da uno specifico anticorpo diretto contro un epitopo inserito all'estremità C-terminale della subunità minore. I geni ricombinanti sono stati clonati nel vettore di trasformazione pUASPattB di Drosophila melanogaster, a valle dell'elemento regolativo UAS (Upstream Activating Sequence), e dunque inseriti nel genoma del moscerino mediante ricombinazione sito-specifica diretta dall'integrasi ΦC31, a seguito di microiniezione in embrioni. Gli individui transgenici sono stati poi selezionati e utilizzati per stabilire ceppi omozigoti che sono stati analizzati per verificare, innanzitutto, che l'espressione dei transgeni AeGGT1 venisse indotta con il sistema binario Gal4-UAS. Esperimenti di RT-PCR, di western blot e di immunofluorescenza hanno effettivamente confermato che entrambi i transgeni sono trascritti ed entrambe le proteine sono prodotte e correttamente localizzate nel sistema eterologo. La proteina AeGGT1V5His viene infatti secreta dalle cellule di Drosophila nell'emolinfa, mimando l'immissione della proteina naturale nell'emocele dell'afide all'atto dell'ovideposizione del parassitoide. La proteina AeGGT1MLGPI disegna i contorni cellulari, legandosi alla superficie extracellulare della membrana plasmatica, dove gli enzimi GGT sono generalmente localizzati negli eucarioti. L'impatto fisiologico dell'espressione della proteina AeGGT1 è stato dunque studiato attraverso analisi fenotipiche. Le femmine transgeniche che esprimono la proteina eterologa AeGGT1 in tutte le cellule del corpo, o solo in una delle due componenti, somatica e germinale, delle ovaie, non hanno rivelato evidenti difetti nello sviluppo delle camere ovariche, come dimostrato sia da sia un test di fecondità, sia da studi morfologici. Ciò indica che, nelle condizioni saggiate, la proteina AeGGT1 non è capace di riprodurre nel moscerino gli effetti apoptotici prodotti nelle ovaie del suo ospite naturale. Questo potrebbe essere semplicemente dovuto ad un insufficiente livello di espressione delle proteine ricombinanti o potrebbe riflettere l'esistenza di importanti differenze fisiologiche tra le cellule germinali di Drosophila e quelle dell'afide. Ho anche verificato se la proteina AeGGT1 potesse alterare i processi di sviluppo del moscerino, ma non ho rilevato differenze significative nelle percentuali di embrioni capaci di svilupparsi in adulti in presenza o in assenza di questa proteina. Sembra dunque che, in condizioni di allevamento normali, la proteina AeGGT1 non influenzi né la fertilità né la vitalità dei moscerini. Tuttavia, quando è stata valutata la resistenza allo stress ossidativo esponendo le Drosophile ad una dose letale di perossido di idrogeno, le femmine transgeniche, che esprimevano la proteina AeGGT1 in tutti i tessuti, hanno mostrato un tempo di sopravvivenza più lungo rispetto a femmine di controllo isogeniche. L'attività GGT, misurata utilizzando uno specifico saggio colorimetrico, è risultata significativamente ridotta nei moscerini transgenici che esprimono la proteina AeGGT1. Infine, ho dimostrato che il silenziamento del principale gene GGT di Drosophila melanogaster (DmGGT1), responsabile dell'80% dell'attività GGT del moscerino, produce a sua volta aumento di resistenza allo stress ossidativo indotto dalla somministrazione orale di perossido di idrogeno. Nell'insieme, questi risultati suggeriscono che la proteina AeGGT1 inibisce l'attività γ-glutammil transpeptidasi endogena del moscerino, provocando accumulo extracellulare di GSH, che, a sua volta, potrebbe conferire protezione dallo stress ossidativo causato dal perossido di idrogeno ingerito. Ne consegue che il sistema di espressione eterologa da me generato per studiare l'azione della proteina AeGGT1 può essere utile per investigare anche aspetti di natura più generale sulle funzioni delle GGT degli insetti. Alla luce dei dati ottenuti, posso infine ipotizzare che gli effetti deleteri prodotti dalla proteina AeGGT1 negli ovari degli afidi parasitizzati dipendano da un'alterazione dell'omeostasi del GSH. Infatti, riducendo l'attività delle GGT endogene, così come accade nelle Drosophile transgeniche, la proteina AeGGT1 rallenterebbe l'ingresso di cisteina nelle cellule dell'ovario. Poiché la cisteina funge da substrato essenziale per la sintesi del GSH, ciò si tradurrebbe in un abbassamento della concentrazione intracellulare di questo importante composto antiossidante. Tale condizione potrebbe essere critica per un tipo di cellule, come quelle delle ovaie degli afidi, che si dividono rapidamente e che potrebbero rispondere a questo sbilanciamento innescando fenomeni apoptotici.

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