De Canditiis, Carolina (2018) Strategie di prevenzione dell’apoptosi indotta dal congelamento per migliorare la criotolleranza di embrioni e gameti bovini. [Tesi di dottorato]

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Item Type: Tesi di dottorato
Lingua: Italiano
Title: Strategie di prevenzione dell’apoptosi indotta dal congelamento per migliorare la criotolleranza di embrioni e gameti bovini
Creators:
CreatorsEmail
De Canditiis, Carolinacarolina.decanditiis@hotmail.it
Date: 10 December 2018
Number of Pages: 170
Institution: Università degli Studi di Napoli Federico II
Department: Medicina Veterinaria e Produzioni Animali
Dottorato: Scienze veterinarie
Ciclo di dottorato: 31
Coordinatore del Corso di dottorato:
nomeemail
Cringoli, Giuseppecringoli@unina.it
Tutor:
nomeemail
Gasparrini, BiancaUNSPECIFIED
Date: 10 December 2018
Number of Pages: 170
Uncontrolled Keywords: crioconservazione, apoptosi, caspasi, embrioni, gameti
Settori scientifico-disciplinari del MIUR: Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/17 - Zootecnica generale e miglioramento genetico
Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/19 - Zootecnica speciale
Date Deposited: 07 Jan 2019 08:58
Last Modified: 23 Jun 2020 09:57
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/12553

Abstract

Diverse strategie sono state sviluppate per minimizzare i danni apoptotici indotti dalla crioconservazione. In particolare, sono stati testati diversi inibitori dell’apoptosi nel tentativo di preservare l’integrità delle membrane senza alterarne il potenziale, ridurre la frammentazione del DNA in seguito all’insulto del congelamento e modulare l’attività delle caspasi bloccando il segnale apoptotico. Pertanto, lo scopo della tesi è stato quello di individuare delle possibili strategie di prevenzione dell’apoptosi indotta dal congelamento, mediante inibizione delle caspasi, al fine migliorare la criotolleranza degli embrioni e dei gameti (oociti e spermatozoi) nella specie bovina. In particolare, è stato investigato l’effetto dell’inibitore delle caspasi Z-VAD-FMK all’interno dei terreni di vitrificazione, scongelamento e coltura per gli embrioni e per gli oociti e dei terreni di congelamento e incubazione per gli spermatozoi al fine di ridurre l’apoptosi e i danni da congelamento, migliorando la criotolleranza post-scongelamento degli embrioni e dei gameti bovini. Lo scopo dell’esperimento 1 è stato quello di valutare l'effetto dell’aggiunta dell’inibitore Z-VAD-FMK (20µM) prima, durante e dopo la vitrificazione sulla criotolleranza degli embrioni bovini prodotti in vitro. A tale fine sono state valutate la sopravvivenza, la progressione allo sviluppo e le percentuali di schiusa delle blastocisti vitrificate dopo 24 e 48 ore di coltura di post-riscaldamento, nonché il numero di cellule embrionali e la loro distribuzione tra trofectoderma e nodo embrionale. Inoltre l’influenza dell’inibitore sull’apoptosi è stata valutata mediante misurazione della frammentazione del DNA e dell’attività della caspasi 3. Lo scopo dell’esperimento 2, è stato quello di studiare gli effetti dell’inibitore Z-VAD-FMK (20µM), prima, durante e dopo la vitrificazione sulla criotolleranza degli oociti bovini maturati in vitro. L’efficacia dell’inibitore sulla prevenzione dell’apoptosi è stata valutata mediante stima della frammentazione del DNA, dell’attività caspasica, del potenziale di membrana mitocondriale, nonché della vitalità e della competenza allo sviluppo embrionale dopo fecondazione in vitro. L’esperimento 3 si è, infine, prefisso l’obiettivo di studiare l’influenza di un trattamento con l’inibitore Z-VAD-FMK (20 e 100 µM) prima, durante e dopo il congelamento sulla criotolleranza degli spermatozoi bovini. L’efficacia del trattamento è stata verificata su diversi parametri indicativi di fertilità spermatica, quali la motilità, la vitalità, l'integrità di membrana, la frammentazione del DNA, l’attività della Caspasi 3 ed il potenziale di membrana mitocondriale. I risultati dell’ esperimento 1 hanno dimostrato che il trattamento con l'inibitore della caspasi Z-VAD-FMK, migliora la criotolleranza degli embrioni bovini prodotti in vitro, prevenendo l'apoptosi indotta da crioconservazione come dimostrato dalle maggiori percentuali di sopravvivenza (76.1 vs 51.1%, P<0.01), sviluppo(63.2 vs 38.5%, P<0.01) e sgusciamento (26.5 vs 17.6%; P<0.05) dopo 48 ore di coltura post-riscaldamento. Inoltre, il trattamento con Z-VAD-FMK ha determinato una riduzione del numero (4.7 ± 0.3 vs 7.7 ± 0.5; P<0,01) e della percentuale (3.4 ± 0.2 vs 6.1 ± 0.5; P<0,01) di cellule con DNA frammentato così come dei livelli di caspasi (1.46 ± 0.17 vs 5.06 ± 0.41, P<0,01) dopo 48 ore di coltura post-riscaldamento. I risultati dell’ esperimento 2 hanno confermato che la vitrificazione determina danni a livello del DNA e del potenziale di membrana mitocondriale che si traducono in una ridotta sopravvivenza e competenza allo sviluppo degli oociti bovini, attestata dalla diminuzione significativa dei tassi di cleavage (73.1 ± 6.1 vs 42.4 ± 1.7, P<0.05) e blastocisti (40.1 ± 8.5 vs 6.7 ± 2.0, P<0.05) . L’ipotesi del lavoro non è però stata confermata, in quanto il trattamento degli oociti con l’inibitore delle caspasi Z-VAD-FMK prima, durante e dopo la vitrificazione, non è risultato efficace nel prevenire l’apoptosi indotta dalla crioconservazione stessa né tantomeno nel migliorare la resistenza degli oociti al processo di crioconservazione. Analogamente i risultati dell’esperimento 3 hanno confermato che il congelamento determina una riduzione della motilità (73.3 ± 1.05 vs 70.0 ± 1.05, P<0.05), della percentuale di spermatozoi con membrana integra (73.8 ± 1.6 vs 67.1 ± 1.2, P<0.05) e della percentuale di spermatozoi che mostravano frammentazione del DNA (1.1 ± 0.6 vs 15.4 ± 2.8, P<0.01). Inoltre, un dato inatteso riguarda, analogamente, però, a quanto riscontrato nell’esperimento 2 sugli oociti, l’inefficacia di Z-VAD-FMK nell’inibire l’attività caspasica, come attestato dall’assenza di differenze tra i vari gruppi nella percentuale di spermatozoi che esprimevano la forma attiva di caspasi. In conclusione, i risultati di questo studio hanno dimostrato che il trattamento degli embrioni bovini prodotti in vitro in presenza di Z-VAD-FMK ne aumenta la criotolleranza limitando l'apoptosi indotta da crioconservazione. Questa potrebbe essere una strategia semplice ed economica per migliorare l'efficienza della crioconservazione degli embrioni bovini, fondamentale per una maggiore diffusione della tecnologia di produzione embrionale in vitro in campo. Tuttavia, la strategia di prevenire l’apoptosi indotta da crioconservazione con Z-VAD-FMK non è perseguibile per migliorare la criotolleranza dei gameti bovini alle dosi testate. Ne consegue la necessità di approfondire lo studio testando diverse concentrazioni dell’inibitore e tempi di esposizione prima di escluderne un potenziale utilizzo come “crioprotettore”.

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