Ambrosone, Alfredo (2008) Strumenti di genomica funzionale per l’identificazione e la caratterizzazione del gene rgga nella risposta allo stress idrico in patata ed Arabidopsis. [Tesi di dottorato] (Inedito)

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PDF (Tesi completa) STRUMENTI_DI_GENOMICA_FUNZIONALE_PER_L'IDENTIFICAZIONE_E_LA_CARATTERIZZAZIONE_DEL_GENE_RGGA_NELLA_RISPOSTA_ALLO_STRESS_IDRICO_IN_PATATA_ED_IN_ARABIDOPSIS.pdf Download (6MB) | Anteprima

Abstract

Il deficit idrico e la presenza di alte concentrazioni di sale nel suolo limitano enormemente la produttività di specie agrarie; si stima che circa il 28% dei suoli coltivabili non abbia una disponibilità adeguata di acqua per la produzione di specie di interesse. La risposta delle piante a stress abiotici è un fenomeno complesso che coinvolge un ampio network di geni. La comprensione dei meccanismi molecolari alla base della risposta allo stress e, soprattutto, dell’adattamento a condizioni ambientali avverse è di fondamentale importanza per l’ottenimento di varietà delle maggiori specie vegetali che garantiscano stabilità di produzione anche in condizioni ambientali sub-ottimali e promuovendo, inoltre, lo sviluppo di un’agricoltura eco-sostenibile. Il presente progetto di ricerca ha avuto come obiettivo l’identificazione e la caratterizzazione di geni la cui espressione è regolata in risposta a carenza idrica in patata (Solanum tuberosum). Allo scopo di identificare geni chiave nella risposta al deficit idrico a breve termine (condizioni di shock) e in quella a lungo termine (condizioni di adattamento), è stato effettuato, inizialmente, uno studio del trascrittoma di colture cellulari di patata in risposta a stress idrico, indotto da polietilene glicole (PEG 20%), attraverso un’analisi microarray. L’analisi dei dati microarray ha permesso l’identificazione di 1055 geni differenzialmente espressi di cui 130 e 337 geni sovraespressi nelle cellule stressate e adattate, rispettivamente. Una dettagliata caratterizzazione dei profili di espressione in cellule di patata sottoposte a stress idrico è stata effettuata, inoltre, mediante quantitative Real Time PCR (qRT-PCR). Lo studio di espressione condotto su un set di 25 geni selezionati ha permesso di confermare e validare i dati ottenuti mediante microarray. Inoltre, i geni selezionati sono risultati regolati da stress anche in foglie e radici provenienti da piante di patata sottoposte a prolungato deficit idrico, confermando il loro potenziale coinvolgimento nei meccanismi di graduale adattamento a condizioni di carenza idrica prolungata. E’ stato effettuato, quindi, un dettagliato studio molecolare e funzionale del gene codificante per una proteina RNA-binding (rgga), la cui espressione è risultata specificamente indotta durante condizioni di adattamento allo stress in cellule ed in piante di patata. La sequenza codificante del gene rgga di S. tuberosum è stata isolata e ulteriormente caratterizzata mediante un approccio bioinformatico, evidenziando elevata similitudine con proteine RNA binding di altre specie vegetali. Una più approfondita analisi di rgga è stata effettuata in Arabidopsis thaliana, l’organismo vegetale modello maggiormente caratterizzato e per il quale sono disponibili validi strumenti di analisi di genomica strutturale e funzionale. In particolare è stato evidenziato mediante qRT-PCR e Northern blotting che l’espressione del gene rgga è indotta in cellule di Arabidopsis in risposta ad alte concentrazioni di NaCl, PEG ed ABA (Acido Abscissico) e in giovani piantine sottoposte a stress osmotico di lunga durata. L’ espressione in vivo di rgga è stata studiata mediante localizzazione del gene reporter GUS clonato a valle del promotore del gene. Il saggio istochimico ha rivelato che rgga è espresso costitutivamente in piante di Arabidopsis; in particolare una forte attività di GUS è stata ritrovata nella radice, nei fasci vascolari, negli stomi e nel polline. L’analisi al microscopio confocale di piante transgeniche esprimenti la proteina di fusione RGGA-YFP (Yellow Fluorescent Protein), ha evidenziato una localizzazione prevalentemente citoplasmatica della proteina di interesse. Al fine di comprendere i meccanismi di risposta e tolleranza in condizioni di carenza idrica, è stato condotto, inoltre, un approccio genetico di “gain and loss of function” mediante l’uso di mutanti knockout (rgga ko) e l’ottenimento di piante transgeniche di Arabidopsis sovraesprimenti rgga (rgga202). Le analisi fenotipiche e fisiologiche in condizioni controllo ed in condizioni di stress hanno evidenziato una scarsa capacità di germinazione nel mutante knockout, rispetto alle piante controllo, in presenza di 120 mM di NaCl. Piante rgga202, invece, sono risultate maggiormente tolleranti rispetto al controllo ed al knockout in condizioni di stress imposte da trattamenti con PEG e NaCl. I risultati ottenuti suggeriscono che rgga riveste un ruolo cruciale nella complessa risposta della pianta a stress osmotico e, in particolare, nei meccanismi cellulari coinvolti nell’adattamento e nella tolleranza.

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