Famiglietti, Maria (2011) STUDIO DEGLI EFFETTI DELL’ESPRESSIONE DI UN GENE VIRALE SULLE RISPOSTE DI DIFESA DELLA PIANTA DI TABACCO. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Abstract

Toxoneuron nigriceps è un parassitoide endofago degli stadi larvali del lepidottero Heliothis virescens ed è associato simbioticamente al polydnavirus TnBV, iniettato nell’ospite al momento dell’ovideposizione. L’espressione nella larva parassitizzata dei geni virali gioca un ruolo importante nella soppressione della risposta immunitaria e nell’alterazioni dell’equilibrio ormonale dell’ospite. Alcuni dei geni coinvolti nella parassitizzazione, e i corrispondenti profili di espressione, sono stati caratterizzati ed il sequenziamento dell’intero genoma del virus è stato completato. Tale sistema biologico offre una opportunità straordinaria di comprensione dei complessi processi fisiologici che regolano le interazioni ospite-parassitoide ed inoltre apre nuove opportunità nell’identificazione di molecole ad attivita biopesticida e quindi di rilevante potenzialità per controllo degli insetti fitopatogeni. Una delle famiglie geniche identificate nel polidnavirus, è caratterizzata da domini ankirina che mostrano alta similarità alle IkB umane e di insetto coinvolte nel signaling NFkB (Falabella et al., 2007). È stato dimostrato che i prodotti IkB virali legano nel citoplasma fattori trascrizionali NFkB/Rel mascherandone i segnali di localizzazione nucleari e impedendone dunque la funzione di regolatori positivi delle difesa immunitaria. Il ruolo chiave in particolare di TnBVank1 nel complesso pathway di alterazioni fisiologiche in Heliothis virescens ne ha supportato l’espressione in tabacco per verificarne l’attivita insetticida e gli effetti sul sistema di difesa vegetale. Piante transgeniche di tabacco che esprimono costitutivamente il gene virale sono disponibili presso il laboratorio dove è stata svolta l’attività di tesi. La caratterizzazione molecolare ha confermato la trascrizione e la traduzione di TnBVank1 in Nicotiana tabacum ed ha mostrato un caratteristico pattern multibanda in western blotting, indice di una possibile interazione della proteina con prodotti endogeni di pianta. Questa ipotesi è compatibile con la struttura di TnBVANK1 che presenta un dominio ankirina molto esteso, costituito da tre ripetizioni, coivolto ubiquitariamente nelle interazione proteina-proteina. Allo scopo di valutare la localizzazione della proteina ricombinante nella cellula vegetale, sono stati allestiti esperimenti di immunolocalizzazione su protoplasti isolati da foglie delle linee transgeniche. Le immagini ottenute tramite microscopia confocale mostrano che la proteina ricombinante è associata alle membrane cellulari. Questo risultato concorda con quanto osservato per AKR2, una IkB-like di Arabidopsis, che interagisce con alcune proteine esterne della membrana dei cloroplasti e per BIANK1 di riso che è associata alla membrana plasmatica (Bae et al., 2010; Zhang et al., 2010). Biosaggi di resistenza a Heliothis virescens, ospite naturale del Toxoneuron nigriceps, sono stati condotti in collaborazione con il Dipartimento di Biologia, Difesa e biotecnologie Vegetali dell’Università di Potenza. I saggi biologici con il lepidottero hanno evidenziato che la presenza del prodotto transgenico all’interno dei tessuti vegetali causa un rallentamento significativo nello sviluppo delle larve che raggiungono il loro massimo incremento ponderale con un ritardo sostanziale rispetto agli insetti controllo. Per verificare un’applicazione del gene virale nella difesa a più ampio spettro è stata investigata l’interazione delle piante transgeniche con il patogeno fungino B. cinerea. Tale biosaggio ha rilevato una maggiore suscettibilità delle linee transgeniche al fungo rispetto i controlli. Per comprendere quali cambiamenti nel profilo trascrittomico delle piante transgeniche rispetto alla wild type interferiscano con l’accrescimetno delle larve di Heliothis e determinino suscettibilità a Botrytis cinerea, sono stati condotti esperimenti microarray con tecnologia Combimatrix. L’analisi trascrittomica ha rivelato che le piante transgeniche trattate con capsiceina, un elicitore che mima l’attacco fungino, accumulano i trascritti di due inibitori di proteasi (PIN1 e “kunits type inhibitor”), la cui attività antimetabolica nei confronti dei fitofagi è già stata ampiamente dimostrata in letteratura (Senthilkumar et al., 2010). Tale evidenza potrebbe spiegare i risultati ottenuti dai saggi biologici con le larve del lepidottero. Tuttavia il ritardo di crescita osservato nel saggio biologico potrebbe essere in parte anche dovuto ad un effetto diretto della proteina eterologa sulla larva di H. viruens, assumendo che la proteina viene in parte assorbita in maniera sufficientemente integra per esplicitare una funzione biologica analoga a quella che si osserva nelle larve parassitizzate. Dall’analisi microarray inoltre è emerso che le piante transgeniche mostrano la sottoespressione di settantadue geni rispetto alla wild type. L’annotazione funzionale delle ESTs ha evidenziato che un considerevole numero di geni è associato al rimodellamento della parete cellulare. In particolare, uno dei geni chiave della biosintesi dei monolignoli (Caffeato 3-O-metiltransferasi, comt) e di numerosi altri geni coinvolti nella biosintesi-turnover della parete cellulare (cellulasi, poligalatturonasi, pectinmetilesterasi, proteine ricche di cisteine) sono sottoespressi nel transgene. Modificazione delle parete cellulare, come ad esempio apposizioni di lignina, possono rafforzare tale barriera e il ruolo della parete risulta determinante nel contenimento degli attacchi di funghi fitopatogeni dotati di meccanismi di penetrazione attiva, tra i quali proprio B. cinerea (Asselbergh et al., 2007). È quindi ipotizzabile che la ridotta espressione di numerosi geni riduca il rafforzamento della parete cellulare dei tessuti transgenici a seguito dell'azione del fungo favorendone la diffusione nell’ospite. Per verificare tale ipotesi sarebbe necessario analizzare la composizione e la struttura della parete cellulare nelle piante transgeniche in seguito ad infezione. In conclusione, l'espressione del gene TnBVank1 in piante di tabacco altera significativamente la risposta molecolare della pianta a seguito di differenti condizioni di stress biotico, instaurando condizioni non sempre favorevoli per la protezione della pianta. Tuttavia, l'incremento della resistenza all'attacco di larve di H. virescens osservata nelle piante che esprimono la proteina virale, rappresenta un interessante risultato che conferma che molecole derivate dai parassitoidi possono essere utili per lo sviluppo di nuove strategie di protezione delle colture (Gill et al. 2006; Maiti et al, 2003). Inoltre tale studio conferma che l’espressione eterologa rappresenta un potente strumento per lo studio funzionale di nuove molecole potenzialmente utili per la protezione delle colture dai stress biotici.

Item Type: Tesi di dottorato
Uncontrolled Keywords: Difesa, Tabacco, Polydnavirus
Depositing User: Anna Tafuto
Date Deposited: 06 Dec 2011 11:29
Last Modified: 17 Jun 2014 06:04
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/8638

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