Bilancione, Marcella (2006) Studio in vitro ed in vivo sulla tossicità dell'ocratossina A: valutazione di alcuni potenziali meccanismi d'azione. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Le ocratossine sono micotossine prodotte da diverse specie di micromiceti del genere Aspergillus e Penicillium. Tali micotossine contaminano soprattutto cereali, prodotti del forno, arachidi, fagioli, legumi in generale, caffè, e mangimi, ma anche vino, birra, frutta secca ed erbe infusionali. L’ocratossina A (OTA) è il metabolita fungino più frequentemente rinvenuto e quello dotato di maggiore tossicità. Essa si ritrova anche nelle carni di maiale e di specie avicole, nelle uova e nel latte di bovina e di donna. All’ocratossina A vengono attribuite proprietà epatotossiche, teratogene, immunotossiche ma soprattutto nefrotossiche e carcinogenetiche. Lo scopo della presente ricerca è stato di dare un contributo al chiarimento dei meccanismi d’azione alla base di alcuni degli effetti indotti nel topo dopo una singola somministrazione orale (10mg/Kg) di OTA. In particolare, è stata indagata l’eventuale azione proinfiammatoria dell’ocratossina A. Mediante saggio della mieloperossidasi, è stata valutata la migrazione e l’accumulo tessutale dei neutrofili che rapidamente infiltrano i tessuti in presenza di uno stimolo flogogeno e, mediante analisi western blot, è stata indagata la modulazione operata dalla micotossina sull’espressione della cicloossigenasi-2 (COX-2) e della proteina da shock termico inducibile hsp72, proteina con funzione citoprotettiva espressa dalle cellule in corso di flogosi. In seguito è stato valutato il grado di perossidazione lipidica eventualmente indotto dall’ocratossina A, attraverso il saggio della malondialdeide. Sono stati, inoltre, analizzati alcuni parametri ematochimici ed urinari per rilevare un possibile danno strutturale e funzionale dei parenchimi renale ed epatico. In una seconda fase della ricerca, è stata condotta una sperimentazione in vitro allo scopo di confermare ed approfondire l’effetto immunomodulatore dell’OTA evidenziato dai risultati dello studio in vivo. A tale proposito è stato scelto, come sistema sperimentale, una linea cellulare continua di macrofagi murini J774 A.1., allo scopo di mimare, in condizioni sperimentali controllate, gli effetti riscontrati nei macrofagi primari. I risultati ottenuti hanno riguardato la capacità della micotossina di modulare la produzione dell’NO, l’espressione della COX-2, dell’hsp72 e dell’NF-kB, fattore coinvolto nei meccanismi a monte di regolazione dell’infiammazione. È risultato evidente che una singola somministrazione di OTA determina, nel topo, effetti nefrotossici ed epatotossici riscontrabili 24 ore dopo il trattamento; effetti correlabili all’innalzamento dell’azotemia (p<0.01) e della GOT (p<0.01). L’analisi western blot eseguita sui lisati di macrofagi peritoneali ha evidenziato che l’OTA induce un aumento dell’espressione della COX-2 e dell’hsp72 negli animali trattati rispetto ai controlli. La micotossina, inoltre, induce un aumento significativo della perossidazione lipidica nei reni e nel fegato (rispettivamente p<0.001 e p<0.01) e determina un aumento significativo dell’infiltrazione dei polimorfonucleati nel duodeno (p<0.05). La sperimentazione condotta in vitro conferma l’effetto immunomodulatore dell’OTA evidenziato nello studio in vivo; infatti, i risultati mostrano che l’ocratossina A induce l’espressione degli enzimi iNOS e COX-2 ed è capace di attivare i meccanismi citoprotettivi costituiti dalle hsp72. Inoltre lo studio in vitro ha consentito di evidenziare come l’induzione della iNOS e della COX-2, da parte dell’OTA, sia regolata da NF-kB. I risultati dello studio mostrano, in conclusione, come l’ocratossina A, alterando la fisiologica composizione della membrana plasmatica (e le funzioni cellulari che da essa dipendono), sia capace di agire su diverse strutture e sistemi inducendo importanti alterazioni biochimiche a loro volta causa di gravi patologie cellulari e d’organo. L’effetto osservato sulle cellule macrofagiche di aumento dell’espressione degli enzimi coinvolti nell’instaurarsi del processo flogistico è correlabile ad un’azione immunostimolante. Tale riscontro fornisce un contributo al chiarimento dei meccanismi alla base della tossicità esercitata dalla micotossina sul sistema immunitario in quanto a tutt’oggi sono riportati in letteratura pareri contrastanti e relativi sia ad una immunosoppressione che, più raramente, alla stimolazione della risposta immunitaria cellulo-mediata.

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