Perna, Fabiana (2013) The role of the Polycomb protein L3MBTL1 in hematopoiesis. [Tesi di dottorato]

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Abstract

Negli ultimi 40 anni, tramite studi di citogenetica sono state identificate diverse alterazioni somatiche ricorrenti nei pazienti con neoplasie ematologiche mieloidi, tra cui le malattie mieloproliferative (MPN), le sindromi mielodisplastiche (MDS) e le leucemie mieloidi acute (AML. Studi genetici e funzionali di queste anomalie hanno consentito di classificarle in un modello definito “two hit” della trasformazione delle cellule emopoietiche (leucemogenesi), che comprende: le mutazioni di classe I, che conferiscono un vantaggio proliferativo attraverso l`attivazione di diverse cascate del segnale (tali mutazioni includono quelle di geni che codificano per membri stessi della trasduzione del segnale o attivatori a valle della trascrizione); e mutazioni di classe II, che determinano il differenziamento mieloide delle cellule staminali attraverso la regolazione dell`espressione genica di target trascrizionali specifici della linea mieloide. Piu` recentemente, sono state identificate nuove mutazioni in aggiunta a quelle precedentemente descritte, che pur verificandosi di frequente nei pazienti con malattie ematologiche neoplastiche, non possono essere classificate come di prima o seconda classe. Queste mutazioni, recentemente identificate, sono a carico di geni che codificano per proteine che regolano la metilazione del DNA (DNMT3a, TET2, IDH1/2 ecc) o le modificazioni post-traslazionali degli istoni (L3MBTL1, PRMT5, ASXL1, MLL, EZH2 ecc). E` di grosso interesse scientifico comprendere il ruolo funzionale di queste alterazioni epigenetiche nella patogenesi delle malattie ematologiche, per poter identificare nuovi target (target epigenetici) terapeutici. In questa dissertazione saranno discussi gli studi che abbiamo condotto per elucidare il ruolo di una delle alterazioni somatiche epigenetiche ricorrenti nelle malattie mieloidi (la delezione della proteina Polycomb L3MBTL1). Questi lavori hanno consentito di dimostrare che questi eventi ricorrenti contribuiscono alla leucemogenesi mieloide. Inoltre, abbiamo dimostrato che diverse mutazioni di classe I e II (per esempio JAK2V617F o AML1/ETO) alterano l`epigenoma delle cellule maligne, in aggiunta ai ruoli classici nel promuovere la proliferazione e il differenziamento delle cellule emopoietiche. Questi dati sottolineano l`importanza delle anormalita` epigenetiche nella patofisiologia delle malattie mieloidi. L3MBTL1 rappresenta l`omologo umano del gene oncosoppressore della drosofila, l(3)mbt [lethal(3)malignant brain tumor], la cui inattivazione determina aumentata proliferazione dei neuroblasti ottici della mosca adulta e delle cellule gangliari del cervello della larva. Dopo aver cristallizato i tre domini in tandem (di circa 100 aminoacidi) MBT fu dimostrato che L3MBTL1 umano compatta la cromatina attraverso il legame con residui lisinici mono- e di-metilati sugli istoni H1 (H1K26) e H4 (H4K20) attraverso il secondo dei suoi tre domini MBT. Subito dopo l`identificazione molecolare di l(3)mbt, Bornemann et al. riportarono che un altro gene della Drosphila, Sex comb on midleg (Scm), codificava per una proteina che conteneva due domini MBT in tandem in posizione N-terminale. Scm fu originariamente identificata come un gene richiesto per l`accurato mantenimento della distribuzione dei geni omeotici durante lo sviluppo e fu pertanto classificato come un repressore Polycomb group (PcG). Infatti, gli embrioni mutanti Scm presentano un classico fenotipo PcG di sviluppo in cui i segmenti anteriori del corpo assumono l`identita` di quelli posteriori (per esempio il torace nell`addome), dovuto alla mancanza di repressione dei geni nel locus bithorax. Il gene umano L3MBTL1, e` localizzato sul braccio lungo del cromosoma 20, in posizione 20q12, nell`ambito della regione comunemente deleta nei pazienti con sindromi mielodisplastiche, malattie mieloproliferative o leucemia mieloide acuta, associate alla delezione del cromosoma 20. La delezione del cromosoma 20 (20q-) rappresenta la seconda anormalita` cromosomica piu` comune nelle neoplasie ematologiche, dopo il cromosoma Philadelphia. L`anormalita` 20q- viene osservata nel 10% dei pazienti con malattie mieloproliferative, di cui la piu` comune e` la Policitemia Vera, nel 4% dei pazienti con malattie mielodisplastiche, e nell`1-2% dei pazienti con Leucemia mieloide acuta. L`inattivazione (o aploinsufficienza) di geni oncosoppressori su 20q potrebbe spiegare la patogenesi di questi disordini. L`espressione di L3MBTL1 nel compartimento ematopoietico (nelle cellule CD34+ che rappresentano le cellule staminali/progenitrici ematopoietiche) e l`assenza di mutazioni a carico dell`allele non deleto, hanno fatto a lungo ipotizzare che l`aploinsufficienza di L3MBTL1 possa contribuire alla patogenesi delle neoplasie ematologiche mieloidi associate alla delezione del cromosoma 20. 1) Per definire il suo ruolo in ematopoiesi e la possibilita` che la sua ridotta espressione nella malattie mieloidi associate a delezione del cromosoma 20 contribuisca alla patogenesi di questi disordini, abbiamo silenziato l`espressione di L3MBTL1 nelle cellule staminali/progenitrici (CD34+) isolate da sangue cordonale (usando short hairpin RNAs). Abbiamo osservato che le cellule staminali emopoietiche deplete per L3MBTL1 dimostrano un aumentato differenziamento verso la linea eritroide. In maniera consistente la overespressione di L3MBTL1 nelle cellule staminali/progenitrici CD34+ come nelle linee cellulari 20q- riduceva il differenziamento eritroide. Inoltre, i livelli endogeni di espressione di L3MBTL1 si riducevano durante il differenziamento eritroide indotto da emina o dall`esposizione a eritropoietina, suggerendo un ruolo specifico per la ridotta espressione di L3MBTL1 nell`indurre le decisioni di differenziamento delle cellule emopoietiche verso la linea eritroide. Il silenziamento di L3MBTL1 aumentava anche la sensibilita` delle cellule staminali progenitrici all`eritropoietina (Epo), con aumentata fosforilazione (indotta da Epo) di STAT5, AKT, and MAPK ed evidente fosforilazione anche in assenza di Epo. Questi dati suggerirono che l`aploinsufficienza di L3MBTL1 contribuisce ad alcune neoplasie mieloproliferative (20q), specialmente la Policitemia Vera, attraverso la promozione del differenziamento eritroide. La Policitemia Vera infatti è una malattia clonale della cellula staminale emopoietica, caratterizzata da una proliferazione persistente ed incontrollata della linea eritropoietica indipendentemente dai meccanismi che fisiologicamente regolano l’eritropoiesi. Nella policitemia vera, la proliferazione eritroide è predominante e determina un aumento numerico dei globuli rossi nel sangue periferico. 2) Per investigare il ruolo di L3MBTL1 come oncosoppressore, abbiamo continuato ad utilizzare un approccio “loss-of-function”, attraverso l`utilizzo di vettori lentivirali che consentono l`espressione di shRNA diretti contro L3MBTL1. Abbiamo trovato che la deplezione di L3MBTL1 nelle cellule umane causa stress replicativo, rottura del DNA, attivazione della risposta al danno del DNA e instabilita` genomica. L3MBTL1 interagisce infatti con Cdc45, MCM2-7 and PCNA, componenti dell`apparato replicativo, necessari per la progressione della replicazione. Questi dati suggeriscono che la delezione di L3MBTL1 causa danno del DNA, tramite la perturbazione della replicazione del DNA. Un`attivata risposta al danno del DNA e l`instabilita` genomica sono aspetti comuni nella tumorigenesi e rappresentano una conseguenza dell`overespressione di molti oncogeni. Questi studi ci hanno consentito di proporre un modello in cui la delezione di L3MBTL1 contribuisce allo sviluppo delle neoplasie ematologiche associate alla delezione del braccio lungo del cromosoma 20 attraverso l`induzione di stress replicativo, danno al DNA e instabilita` genomica. 3) Per definire come L3MBTL1, una proteina del gruppo Polycomb con attivita` trascrizionali di repressione, regola gli eventi iniziali del differenziamento, abbiamo creato delle linee cellulari embrionali che constitutivamente eprimono shRNA diretti contro L3MBTL1. Il silenziamento di L3MBTL1 nelle cellule umane embrionali consentiva una normale morfologia, proliferazione, cinetica di ciclo cellulare, normali marcatori di superficie e cariotipo dopo 40 passaggi. Pero`, sotto condizioni che promuovevano il differenziamento spontaneo, le cellule embrionali senza L3MBTL1 si differenziavano in una popolazione relativamente omogenea di cellule larghe, piatte, tipo trofoblasti, a differenza del differenziamento multilineare delle cellule di controllo. Le cellule senza L3MBTL1 esprimevano numerosi marcatori della linea trofoblastica e secernevano ormoni placentari. Nonostante le cellule senza L3MBTL1 potevano essere indotte a differenziare in varie linee embrionali, esse adottavano un destino esclusivamente trofoblastico durante il differenziamento spontaneo. Questi dati dimostrano che la deplezione di L3MBTL1 non disturba il self-renewal delle cellule embrionali, ma piuttosto aumenta il differenziamento verso tessuti trofoblastici extraembrionali. Questo fenotipo risultava molto simile a quello delle cellule embrionali trattate con BMP4 e infatti il trattamento con BMP4 riduceva il livello di espressione endogena di L3MBTL1. Questi dati suggerivano che la deplezione di L3MBTL1 potrebbe essere responsabile dell`attivazione della cascata del segnale di BMP4. 4) Infine, piu` recentemente abbiamo dimostrato che L3MBTL1 regola l`espressione di un fattore di trascrizione specifico per la linea eritroide EKLF. L3MBTL1, che generalmente funziona come repressore trascrizionale, regola la trascrizione di smad5 e controlla pertanto la cascata del segnale BMP4/smad5 e i suoi effettori a valle, incluso EKLF. Data la rilevanza clinica di regolare l`espressione dei geni globinici da parte di EKLF nelle emoglobinopatie, abbiamo utilizzato un modello umano di beta-emoglobinopatia, cioe` le cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti. Queste cellule sono state infettate con vettori lentivirali per esprimere shRNA contro L3MBTL1 e si sono mostrate capaci di generare una progenie eritroide che esprime alti livelli di espressione dei geni globinici e di fattori della trascizione a valle di BMP4, incluso EKLF. Pertanto, pensiamo che L3MBTL1 possa modulare l`induzione dell`espressione di EKLF, attraverso la modulazione del pathway BMP4/smad5, regolando infine l`espressione dei geni globinici e servendo pertanto come potenziale approccio terapeutico per le emoglobinopatie. PRMT5 e` un`arginina metiltransferasi di tipo II che fu inizialmente identificata come una proteina che lega JAK (JAK-binding protein 1 - JBP1) nei lieviti. PRMT5 media la dimetilazione simmetrica dei residui argininici sugli istoni H2A, H3, e H4, e metila altre proteine cellulari come p53, SPT5, e MBD2. Insieme a MEP50, che contiene il dominio WD40 e con pICln, PRMT5 forma un grosso complesso proteico 20S con funzione di metiltransferasi, chiamato il “metilosoma”. Questo complesso funziona nel processamento dell`RNA attraverso la metilazione di proteine Sm e ha un ruolo anche nella biogenesi delle snRNP. PRMT5 e` stata anche ritrovata nei complessi che rimodellano la struttura della cromatina hSWI/SNF e NURD, dove puo` esercitare controllo trascrizionale sulla espressione dei geni bersaglio. Per studiare le malattie mieloproliferative indotte dalla mutazione JAK2V617F, abbiamo ricercato l`interazione in vivo tra PRMT5 e le chinasi oncogeniche mutanti JAK2 (JAK2V617F e JAK2K539L), e abbiamo determinato come questa interazione contribuisce al fenotipo mieloproliferativo che inducono. La mutazione JAK2V617F constitutivamente attiva la tirosina chinasi JAK2 ed e`espressa nella maggior parte dei pazienti con malattie mieloproliferative. Abbiamo trovato che la proteina mutata JAK2V617F (e JAK2K539L) si lega a PRMT5 in maniera piu` forte della proteina JAK2 wild-type. Queste chinasi oncogeniche (mutazioni di classe I) acquisiscono anche la capacita` di fosforilare PRMT5, riducendo la sua capacita` di metilare i suoi substrati istonici, e rappresentando una specifica acquisizione di funzione che consente loro di regolare le modificazioni cromatiniche. Abbiamo documentato la fosforilazione di PRMT5 nei campioni di pazienti positivi per JAK2V617F e quando abbiamo silenziato l`espressione di PRMT5 nelle cellule umane CD34+ usando shRNA, abbiamo osservato un’aumentata formazione di colonie e differenziamento eritroide. Questi risultati indicano che la fosforilazione di PRMT5 (con funzione epigenetica) contribuisce al fenotipo delle malattie mieloproliferative indotte dalla mutazione classica di JAK2. CONCLUSIONI La nostra conoscenza dei meccanismi che promuovono la trasformazione mieloide si e` molto evoluta negli ultimi anni grazie all`approfondimento degli eventi genetici che sono stati identificati nei pazienti con questi disordini. Inoltre l`identificazione di mutazioni nei geni coinvolti nella regolazione epigenetica ha rivelato nuovi meccanismi di trasformazione. Regolatori della metilazione del DNA (come TET2, IDH1, IDH2 e DNMT3A) e delle modificazioni degli istoni (come L3MBTL1, PRMT5, MLL, ASXL1 e EZH2) rappresentano il bersaglio di alterazioni somatiche in una percentuale significativa di pazienti con malattie mieloidi. Questo suggerisce un ruolo cruciale per i modificatori epigenetici nella regolazione della emopoiesi normale e illustra come la perdita della funzionalita` epigenetica normale puo` contribuire alla leucemogenesi. Pertanto, elucidare l`impatto delle mutazioni epigenetiche sulla leucemogenesi e la risposta terapeutica sara` essenziale per l`avanzare delle nostre conoscenze e il trattamento delle malattie mieloidi. La nostra comprensione delle conseguenze biologiche di questi cambiamenti epigenetici e` ancora a uno stadio iniziale. Nonostante possiamo capire l`attivita` specifica di un singolo gene e derivare modelli generali di come le modificazioni epigenetiche influenzano la trascrizione, non conosciamo ancora i componenti cruciali che sono alterati da queste modificazioni epigenetiche e come queste influenzano l`andamento epigenetico, l`espressione genica e le alterazioni fenotipiche delle cellule emopoietiche. Per definizione, le mutazioni in questa classe di geni influenzano globalmente la mappa cromatinica e molti geni e pathway ne risultano alterati; per cui, e` improbabile che una spiegazione semplice e lineare possa spiegare come queste mutazioni contribuiscono allo sviluppo della leucemia. L`espressione genica e l`analisi epigenomica hanno identificato un gruppo di geni bersaglio dei modificatori epigenetici, come il cluster genico HOX, che sono essenziali per la trasformazione maligna da parte di specifiche mutazioni epigenetiche. Quel che abbiamo imparato e` che queste mutazioni nei modificatori epigenetici non ricadono nella classificazione precedentemente stabilita di mutazioni di classe I o II della leucemogenesi. Clinicamente, le mutazioni epigenetiche si verificano in combinazione con una delle mutazioni di classe I o II o con entrambe. I dati attuali genetici e funzionali suggeriscono che le mutazioni nei modificatori epigenetici ricadono in almeno due nuove classi: quella delle mutazioni che influenzano la idrossimetilazione del DNA (TET2, IDH1 and IDH2), e quella delle mutazioni che direttamente regolano la metilazione del DNA e/o degli istoni (L3MBTL1, PRMT5, MLL, ASXL1 e DNMT3A). Queste due nuove classi di mutazioni epigenetiche probabilmente contribuiscono alla trasformazione leucemica influenzando la regolazione epigenetica, pertanto generando un panorama dello stato della cromatina che puo` mantenere e cooperare con l`effetto delle mutazioni di classe I o II. Studi ulteriori sono necessari per chiarire queste possibilita` e capire come diverse combinazioni di genotipi di alleli associate alla leucemia risultano in fenotipi di leucemia mieloide distinti in termini biologici, terapeutici e prognostici.

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