Di Giacomo, Marikagiusy (2025) DEVELOPMENT OF BIOCATALYTIC PROCESSES FOR CO₂ CAPTURE AND UTILIZATION. [Tesi di dottorato]

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Abstract

Negli ultimi anni, la necessità di disporre di tecnologie a basso impatto ambientale per la cattura e l’utilizzo della CO₂ (Carbon Capture and Utilization - CCU) ha stimolato l’impiego di processi biocatalitici in grado di coniugare selettività, sostenibilità e compatibilità con i processi già in corso di avanzato sviluppo e basati su tecnologie termo-catalitiche. In questo scenario, il lavoro di tesi ha seguito due linee complementari dirette allo sviluppo di un processo combinato basato sulla catalisi enzimatica dell’assorbimento della CO₂ in solventi alcalini e alla sua conversione in acidi carbossilici fenolici attraverso i) l’impiego di una anidrasi carbonica ingegnerizzata di Desulfovibrio vulgaris (DvCA8.0) come biocatalizzatore del processo di assorbimento biomimetico della CO₂ da fumi di combustione eventualmente combinato con un processo di “accelerated limestone weathering” (ALW); ii) lo sviluppo di protocolli di immobilizzazione per delle decarbossilasi prive di cofattore (2,3-diidrossibenzoato decarbossilasi di Aspergillus oryzae (2,3-DHBD_Ao) e 2,6-diidrossibenzoico acido decarbossilasi di Rhizobium sp. (2,6-DHBD_Rs) da impiegare in processi di carbossilazione di composti fenolici sfruttando le correnti liquide arricchite in bicarbonato che risultano come intermedi del processo biomimetico di cattura della CO₂. Lo sviluppo dei due biocatalizzatori è stato affrontato come il primo passo verso la messa a punto delle tecnologie che permettono di combinare il processo di assorbimento della CO₂ catalizzato dall’anidrasi carbonica con la carbossilazione di substrati fenolici catalizzata dalle decarbossilasi come soluzione alla valorizzazione di parte delle correnti di bicarbonato risultanti dalla cattura della CO₂ in solventi alcalini insieme a substrati fenolici di origine biogenica (fenoli dal frazionamento di bio-olii di pirolisi). Lo sviluppo dei biocatalizzatori è stato affrontato con uno screening di strategie di immobilizzazione basate sul legame covalente tra enzima e supporti solidi granulari che permettessero una stabile ritenzione degli enzimi anche nelle condizioni aggressive dei processi target (pH alcalini ed elevate concentrazioni di carbonati). Per la DvCA8.0 si è privilegiato l’uso di nanoparticelle magnetiche per poter garantire la separazione del biocatalizzatore disperso anche dagli slurry di scarti di calcare utilizzati come materia prima per il processo ALW. Pertanto, DvCA8.0 è stata immobilizzata su nanoparticelle magnetiche mediante attivazione con carbodiimmide. Tale tecnica permette il legame dell’enzima coinvolgendo il C terminale e preservando l’attività. Il protocollo, precedentemente ottimizzato per un’altra CA, è risultato robusto confermando un carico di circa 50mg/g con un’ottima attività dell’enzima immobilizzato (resa prossima al 100%). Infatti, la DvCA8.0 immobilizzata ha mostrato un incremento della velocità di idratazione della CO₂ che si traduce in un’accelerazione della velocità di assorbimento della CO₂ nel solvente alcalino con prestazioni confrontabili con quelle della forma libera suggerendo pertanto una buona scalabilità grazie alla possibilità di separare le nanoparticelle magnetiche e riutilizzarle in più cicli oppure in opportuni sistemi di contatto gas-liquido per la cattura in continuo della CO₂. L’applicazione della DvCA8.0 immobilizzata al processo ALW ha confermato il contributo del biocatalizzatore nell’incrementare indirettamente la dissoluzione del carbonato in presenza dell’acido carbonico che deriva dall’assorbimento della CO₂. Le dimensioni fini degli aggregati di nanoparticelle hanno favorito l’interazione della DvCA8.0 immobilizzata con la CO₂ disciolta in prossimità dell’interfaccia liquido-solido e impedito il deposito di enzima sulla superficie del calcare in polvere. La possibilità di separare in campo magneti il biocatalizzatore disperso e la stabilità della DvCA8.0 immobilizzata hanno permesso di ripetere cicli di ALW come primo esempio di applicazione del processo in condizioni rilevanti. La seconda parte dello studio è stata incentrata sullo sviluppo di una tecnica di immobilizzazione covalente delle DHBD, enzimi che si presentano in forma nativa come omo-tetrameri e la cui attività in vitro è legata alla principalmente alla forma monomerica. le tecniche covalenti sono di nuovo state considerate come target per garantire la stabilità in presenza delle soluzioni ricche di bicarbonato e fenoli e per ottenere dei biocatalizzatori compatibili con l’utilizzo in bioreattori continui a letto impaccato. Pertanto, si sono selezionati supporti commerciali già attivi e supporti a base di agarosio da attivare. In entrambi i casi i parametri di ottimizzazione hanno incluso la resa di immobilizzazione e il carico di enzima per unità di massa di supporto, l’attività catalitica apparente (resa in attività), la stabilità in condizioni rilevanti per il processo anche legata al rilascio dell’enzima. Lo screening avviato con le tecniche di indagine cromatografiche già consolidate in letteratura per la caratterizzazione dell’affinità delle DHDB verso numerosi substrati fenolici, ha richiesto un perfezionamento di un saggio di attività (decarbossilazione) basato su misure di assorbanza UV di substrato e prodotto (acido 2,3-diidrossibenzoico e catecolo). Questo passaggio preliminare ha permesso di agevolare l’indagine sull’immobilizzazione delle DHDB su supporti a base di agarosio. Inoltre, la disponibilità di una tecnica analitica basata su spettroscopia UV offre future opportunità per la caratterizzazione del processo di carbossilazione in bioreattori continui attraverso la misura simultanea di acido 2,3 diidrossibenzoico e catecolo. L’enzima 2,3-DHBD_Ao è stato selezionato tra i due inizialmente prodotti per la migliore produttività del processo di produzione come proteina ricombinante. I risultati indicano che i supporti commerciali (Immobead150® e Sipernat®22) modificati con gruppi amminici garantiscono il carico di enzima maggiore (fino a 70 mg/g) corrispondente a rese in attività intorno al 30%. Inoltre, 2,3-DHDB_Ao immobilizzata su Immobead150® modificato è stata impiegata con successo in test di carbossilazione del catecolo. Questo risultato suggerisce questo tipo di tecnica di immobilizzazione per futuri studi di scale-up del processo e di realizzazione di bioreattori continui per la carbossilazione di fenoli. L’indagine sull’immobilizzazione di 2,3-DHDB_Ao su supporti a base di agarosio funzionalizzato con ammine ha permesso di individuare nell’interazione con la glutaraldeide il passaggio che maggiormente influenza la resa in attività. Infatti, le tre modalità di immobilizzazione utilizzate hanno mostrato una resa di attività variabile da circa il 70% per l’enzima adsorbito su agarosio glicossilato e funzionalizzato con MANAE a circa il 10% dell’enzima legato covalentemente sullo stesso supporto attivato con dimeri di glutaraldeide. La stabilizzazione dell’enzima adsorbito attraverso crosslinking con glutaraldeide ha fornito un risultato intermedio (34%) che prospetta ulteriori indagini soprattutto per migliorare il loading e il suo effetto sull’attività apparente dell’enzima. In conclusione, lo studio ha posto le basi per lo sviluppo di un processo di carbossilazione enzimatica catalizzato da 2,3-DHDB_Ao prive di cofattore e ha confermato la possibilità di impiegare le anidrasi carboniche immobilizzate per il primo step di cattura della CO₂. In quest’ultimo caso la robustezza del biocatalizzatore ha permesso di verificare la fattibilità di un ulteriore processo di cattura e stoccaggio temporaneo della CO₂ basato sulla dissoluzione di scarti di calcare. Lo studio ha permesso di individuare alcune criticità legate sia alle prestazioni e potenzialità delle DHDB come biocatalizzatori industriali sia alle condizioni di processo che permetterebbero la massimizzazione della conversione dei fenoli in acidi carbossilici. Infatti, la natura multimerica delle DHBD e la resa del processo di produzione e purificazione dell’enzima ricombinante hanno influenzato l’indagine sullo screening delle tecniche di immobilizzazione e in futuro potranno essere oggetto di ulteriori studi (ad es. per combinare purificazione e immobilizzazione). La stabilità dell’enzima in soluzioni con pH>9 e l’effetto, ancora non completamente caratterizzato, della CO₂ disciolta sulla cinetica della reazione di carbossilazione nonché sulle prestazioni massime ottenibili in termini di conversione dei fenoli limitano le prestazioni dei biocatalizzatori solidi ottenuti. Pertanto, il perfezionamento del biocatalizzatore e il suo utilizzo in bioreattori continui dovrà tenere conto di tali osservazioni per l’individuazione di opportune condizioni operative nei limiti delle soluzioni offerte dal processo di cattura enzimatica prima tra tutti la composizione delle correnti arricchite in bicarbonato di potassio quali vettori di CO₂.

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