Pucci, Biagio (2006) Relazioni struttura funzione della DNA elicasi MCM del crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. [Tesi di dottorato] (Inedito)

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Tipologia del documento:	Tesi di dottorato
Lingua:	Italiano
Titolo:	Relazioni struttura funzione della DNA elicasi MCM del crenarchaeon Sulfolobus solfataricus
Autori:	Autore Email Pucci, Biagio [non definito]
Data:	2006
Tipo di data:	Pubblicazione
Numero di pagine:	70
Istituzione:	Università degli Studi di Napoli Federico II
Dipartimento:	Biologia strutturale e funzionale
Dottorato:	Biologia applicata
Ciclo di dottorato:	18
Coordinatore del Corso di dottorato:	nome email De Felice, Maurilio [non definito]
Tutor:	nome email Ricca, Ezio [non definito]
Data:	2006
Numero di pagine:	70
Parole chiave:	Replicazione del DNA, Mini-Chromosome Maintenance (MCM), Archaea, Sulfolobus solfataricus
Settori scientifico-disciplinari del MIUR:	Area 05 - Scienze biologiche > BIO/19 - Microbiologia generale
Depositato il:	31 Lug 2008
Ultima modifica:	30 Apr 2014 19:24
URI:	http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/1005
DOI:	10.6092/UNINA/FEDOA/1005

Abstract

Il progetto scientifico sviluppato durante il triennio del Dottorato di ricerca ha riguardato lo studio delle relazioni struttura-funzione della DNA elicasi dall’archaeon iper-termofilo Sulfolobus solfataricus (SsoMCM). La replicazione del DNA negli eucarioti è caratterizzata dall’interazione di molti fattori proteici che coordinano in maniera altamente precisa una serie di eventi culminanti con la duplicazione del materiale genetico prima del completamento della divisione cellulare. Il completo sequenziamento del genoma di molte specie archeobatteriche ed i primi studi effettuati sul sistema replicativo di tali organismi indicano l’esistenza di una forte similitudine con il sistema eucariotico. Infatti, i complessi molecolari degli Archaea coinvolti nella replicazione del DNA sono costituiti da fattori proteici più simili a quelli eucariotici che non batterici e questo fa degli Archaea un ottimo modello di studio per comprendere i meccanismi biologici che regolano il complicato macchinario replicativo eucariotico. Lo studio dell’ipotetica DNA elicasi replicativa SsoMCM è un perfetto esempio in tal senso. Infatti, nel genoma di Sulfolobus solfataricus è presente un unico omologo delle proteine che compongono il complesso proteico MCM 2-7 eucariotico (Mini-Chromosome Maintenance). Studi preliminari hanno evidenziato che SsoMCM è un omo-esamero ed appartiene alla super-famiglia delle ATPasi con varie Attività cellulari Associate (AAA+ super-family), è in grado di legare differenti tipi di molecole di DNA e mostra un’attività DNA elicasica, ATPasi-dipendente, con polarità 3’->5’. Studi strutturali mediante microscopia elettronica ad elevata risoluzione e cristallografia ai raggi-X della proteina MCM dell’archaeon Methanothermobacter thermoautotrophicum (MthMCM) hanno dimostrato che essa è costituita da due esameri giustapposti, ciascuno dei quali delimita un canale centrale carico positivamente che si ritiene leghi il DNA. Grazie all’allineamento tra le sequenze altamente simili di MthMCM e di SsoMCM, perfezionato sulla base della struttura cristallografica recentemente risolta di un frammento di circa 300 residui di MthMCM, è stato possibile identificare aminoacidi con carica positiva di SsoMCM putativamente localizzati nel canale centrale e coinvolti nel legame al DNA. Tali aminoacidi (Lisine 129, 134, 194 ed Istidina 146) sono stati sostituiti con residui di Alanina mediante mutagenesi sito-diretta. Si è dimostrato che le proteine mutanti formano correttamente omo-esameri in soluzione e conservano una attività ATPasica paragonabile a quella della proteina wild type. Mediante analisi per EMSA e saggi enzimatici è stato possibile dimostrare che sono critici per il legame al DNA e/o l’attività DNA elicasica, mentre la sostituzione del residuo aminoacidico K134 con Alanina ha effetto solo sul legame al DNA a doppio filamento e non sul legame al DNA a singolo filamento ne sull’attività DNA elicasica dell’enzima. Grazie alla analisi suddetta, sono stati individuati altri residui basici (Lisina 246 ed Arginine 247, 250) situati in β-hairpin fingers ipoteticamente orientati verso il canale centrale in SsoMCM. La loro sostituzione con Alanina determina una sostanziale riduzione sia del legame al DNA che dell’attivita enzimatica. Inoltre, mediante tecniche di spettroscopia di fluorescenza sono stati monitorati cambi conformazionali di tali β-hairpin fingers promossi dal legame di SsoMCM a vari nucleotidi (ATP, ADP, ADP-AlF4-). L’effetto più importante si è osservato quando gli spettri sono stati registrati in presenza di ADP o ADP-AlF4-, un analogo dello stato di transizione della reazione di idrolisi dell’ATP. Questi risultati suggeriscono che l’idrolisi, piuttosto che il legame, dell’ATP determina il movimento di tali elementi di struttura necessario per la funzione di remodeling del DNA da parte di SsoMCM.

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