Criscuolo, Giuseppina (2015) Studio dell'attività anti-microbica e delle proprietà anti-infiammatorie di una molecola secreta da Lactobacillus gasseri SF1109. [Tesi di dottorato]

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Negli ultimi anni sono stati realizzati molti studi che dimostrano la produzione, da parte dei batteri del microbiota intestinale, di numerosi agenti anti-microbici come: batteriocine, piccoli peptidi, perossido d'idrogeno e acidi organici. Questi batteri e le molecole da essi prodotti competono per i siti di adesione cellulare e inibiscono la produzione di fattori di virulenza (Walker WA. 2008) associati a microrganismi patogeni come, ad esempio, al batterio P. aeruginosa (Alexandre Y. et al. 2014). Inoltre, i probiotici sono degni di nota anche per la capacità di stabilire complesse interazioni con le cellule del tratto gastro-intestinale e tali interazioni sono essenziali per il benessere dell'organismo (Lozupone CA. et al. 2012). In particolare, essi sono in grado di produrre molecole che modulano l'apoptosi, la proliferazione cellulare e l'infiammazione. Lo scopo del mio progetto di dottorato è consistito nello studiare l'attività anti-microbica e le proprietà anti-infiammatorie di una molecola secreta dal ceppo L. gasseri SF1109. In primo luogo è stato realizzato uno screening di alcuni ceppi di Lattobacilli, disponibili nel laboratorio di Microbiologia presso cui ho svolto la mia attività di dottorato, per la produzione di molecole anti-microbiche. Tali ceppi, isolati da biopsie ileali di individui sani (Fakhry S. et al. 2009), sono stati analizzati mediante saggi di attività anti-microbica. Il sopranatante, che per semplicità indicherò come CFS (cell-free supernatant), proveniente dai singoli ceppi di Lattobacilli, è stato saggiato contro ceppi patogeni di P. aeruginosa (AA2, BT72, KK27, MF51, PA14, RP73, TR1) (Bragonzi A. et al. 2006; 2009). Tra i vari ceppi di Lattobacilli analizzati (Lactobacillus mucosae SF1031, Lactobacillus mucosae SF1087, Lactobacillus mucosae SF1091, Lactobacillus mucosae SF1108, Lactobacillus gasseri SF1109, Lactobacillus mucosae SF1111, Lactobacillus mucosae SF1146, Lactobacillus gasseri SF1183, Lactobacillus mucosae SF1232, Lactobacillus mucosae SF1233) il CFS proveniente da L. gasseri SF1109 ha mostrato la più forte attività anti-microbica contro i sette ceppi indicatori di P. aeruginosa. Poiché molti lavori di letteratura hanno dimostrato che mezzi di coltura e fattori fisici ben controllati sono richiesti per ottenere la maggiore produzione di molecole anti-microbiche (Iyapparaj P. et al. 2013; Jimenez-Diaz R. et al. 1993), la prima parte del mio lavoro sperimentale ha avuto come obiettivo l'ottimizzazione della produzione di eventuali molecole anti-microbiche presenti nel CFS di L. gasseri SF1109, variando pH e temperatura di crescita e scegliendo i valori ottimali per la maggiore resa di molecole anti-microbiche. Inoltre, il CFS è stato trattato a varie temperature al fine di capire se fosse termoresistente, poiché vari studi hanno dimostrato che le molecole anti-microbiche prodotte dai batteri acido lattici sono resistenti a forti stress termici (Cotter P. D. et al. 2013). Il CFS è maggiormente attivo in un determinato intervallo di pH, dimostrando, come riportato in letteratura, la forte correlazione tra pH e attività anti-microbica (Jimenez-Diaz R. et al. 1993). Successivamente per avere indicazioni sulla taglia della molecola anti-microbica il CFS è stato frazionato utilizzando filtri con cut-off di 3kDa. Inoltre, sono stati condotti esperimenti di microscopia a fluorescenza per avere indicazioni sull'interazione del CFS con le cellule dei ceppi batterici indicatori. In maniera analoga a quanto realizzato usando come indicatori i ceppi di P. aeruginosa, poiché L. gasseri SF1109 è un ceppo intestinale, il CFS è stato saggiato anche contro ceppi patogeni intestinali, ottenendo risultati analoghi e dimostrando che l'eventuale molecola anti-microbica contenuta nel CFS ha un ampio spettro d'azione. Numerosi studi testimoniano che il microbiota intestinale, oltre a produrre un gran numero di molecole anti-microbiche, è in grado di regolare una serie di processi infiammatori intestinali (Shimazu T. et al. 2012). Pertanto, si è deciso di studiare gli effetti del CFS di L. gasseri SF1109 su una linea di adenocarcinoma del colon (HCT116) in seguito ad induzione pro-infiammatoria con LPS purificato da E. coli (Villena J. et al. 2014; Lu YC. et al. 2008). In tale lavoro di tesi è stata analizzata la risposta delle cellule HCT116, andando a studiare il possibile effetto anti-infiammatorio del CFS sui membri della famiglia delle MAPKs (p-ERK 1/2, p-JNK e p-p38). Il passo successivo è stato quello di indagare mediante esperimenti di citometria di flusso sull'effetto del CFS sulla proliferazione delle cellule HCT116. In parallelo l'espressione di marcatori del ciclo cellulare, come p21WAF1 e ciclina D1, ha permesso di valutare gli stessi effetti a livello molecolare. Inoltre, sono stati compiuti esperimenti per valutare la tossicità del CFS sulla linea cellulare intestinale HCT116. Il CFS di L. gasseri SF1109 è stato sottoposto ad una caratterizzazione chimica mediante cromatografia di esclusione molecolare, in collaborazione con il gruppo di ricerca del Dott. Alessandro Pezzella (Dipartimento di Chimica, Università Federico II). In modo parallelo le frazioni ottenute dopo cromatografia sono state saggiate per verificarne l'attività anti-microbica, quella anti-infiammatoria ed infine gli effetti sul ciclo cellulare, al fine di capire se la molecola contenuta nel CFS possedesse tutte le attività biologiche descritte. La frazione attiva è stata analizzata mediante spettrometria di massa (AP-MALDI) e Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), queste analisi hanno portato all'identificazione di un piccolo peptide, di circa 1333 Dalton, contenente un residuo di Tirosina ed uno di Fenilalanina, il resto della struttura è in via di elucidazione, probabilmente il resto della sequenza è costituito da aminoacidi modificati (Nakamura H. et al. 2015). Una volta compresa l'intera sequenza aminoacidica, sarà possibile ottenere in forma pura il peptide, al fine di validare i risultati ottenuti con il CFS sia su cellule batteriche che su cellule eucariotiche e di realizzare studi più dettagliati per comprendere il meccanismo d'azione del peptide attivo.

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