Drongitis, Denise (2015) Studi molecolari dello stato della cromatina dopo induzione della Spreading Depression in cellule nervose. [Tesi di dottorato]

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Attraverso il fenomeno di Preconditioning il cervello acquisisce la capacità di tollerare insulti di tipo letale, se esposto in precedenza a stimoli subletali. Negli ultimi anni la neuroprotezione indotta dal fenomeno del Preconditioning è diventata oggetto di numerosi studi; comprendere infatti come il cervello riesca a proteggersi da una vasta gamma di stimoli nocivi potrebbe essere la chiave per la scoperta di terapie utili alla cura di numerose patologie. Uno degli stimoli più studiati che possono indurre Preconditioning è la Spreading Depression (SD), un'onda di depolarizzazione neuronale associata ad una depressione spontanea dell'attività bioelettrica neurale che permane per parecchi minuti. Era già stato dimostrato in precedenza una correlazione tra il fenomeno del Preconditioning, indotto da Spreading Depression, e cambiamenti cromatinici del genoma a livello globale correlati a cambiamenti nel livello di metilazione istonica a carico di lunghe sequenze ripetute (Passaro et al., 2010; Rana et al., 2012). Per caratterizzare in modo più dettagliato il quadro delle modifiche epigenetiche associate al Preconditioning sono stati valutati i livelli di metilazione del DNA di due sottofamiglie di lunghe sequenze ripetute, LINE1 e L1. Tali sequenze risultano essere ipermetilate in cortecce cerebrali di ratto trattate per la SD. Questi dati trovano inoltre riscontro con l'aumento del livello di espressione dei geni codificanti per le DNA metiltrasferasi (DNMT1, DNMT3a,DNMT3b), enzimi deputati alla metilazione del DNA. L'ipermetilazione delle sequenze LINE1 ed L1 è in accordo con la diminuzione del livello dei trascritti di entrambe queste sequenze in cortecce di ratto precondizionate. Tali risultati sono in linea con i dati pubblicati in precedenza e corroborano l'ipotesi che il Preconditioning indotto da SD utilizzi come meccanismo di neuroprotezione l'aumento della stabilità genomica tramite il silenziamento dei retrotrasposoni. E' stato inoltre sviluppato in sistema modello in vitro per lo studio del Preconditioning, utilizzando una linea cellulare di neuroblastoma umano (SHSY5Y). Questo approccio permette di valutare gli effetti del Preconditioning su una popolazione omogenea di cellule neuronali umane e di beneficiare di una grande quantità di materiali biologico di partenza. In questo sistema abbiamo dimostrato che sia le cellule SHSY5Y non differenziate che quelle differenziate con acido retinoico mostrano una maggior resistenza al danno molecolare indotto da H2O2, se precondizionate con KCl. In tale sistema modello si è inoltre andati a valutare cambiamenti nel livello di espressione di specifici geni neuroprotettivi (BDNF, BDNF-AS, HIF1a, c-Fos), che mostrano un aumento del livello del trascritto sia in risposta al Preconditioning sia in risposta al Preconditioning e danno molecolare. In conclusione, i nostri risultati confermano l'ipotesi di un ruolo centrale per le modifiche epigenetiche nel meccanismo di neuroprotezione indotto dal Preconditioning.

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