Russo, Michela (2006) Studio degli effetti dei componenti del fumo di tabacco in cellule neuronali in un modello di stress ossidativo in vitro. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Oggi il tabagismo costituisce un importante problema socio-sanitario su cui sono state condotte innumerevoli ricerche. Ciononostante anche se sono ben conosciuti tutti gli effetti farmacologici della nicotina, poco si sa delle sostanze che costituiscono quello che viene chiamato "condensato", in particolare a livello del SNC. È noto che i componenti il fumo di tabacco è costituito da due ingredienti: la nicotina e il condensato. La nicotina è un alcaloide estratto dalla pianta del tabacco che assume colorazione bruna e tipico odore di tabacco dopo esposizione all’aria e si presenta in forma liquida. Abbiamo studiato l’effetto di numerose concentrazioni di nicotina su neuroni in coltura, cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y al fine di individuare eventuali concentrazioni tossiche. Per valutare l’eventuale effetto neuroprotettivo, rivelato in alcune condizioni sperimentali in cui si ipotizza un danno ossidativo –cellule trattate con β–amiloide –è stato valutato l’effetto della nicotina sul danno neuronale indotto da un agente ossidante, il tert-butile idroperossido, in grado di indurre apoptosi neuronale attraverso la produzione di ROS [Amoroso et al. 1999, 2002]. La nicotina esercita un effetto tossico solo alle concentrazioni di 10mM, concentrazioni molto elevate e lontane da quelle che si ottengono in un fumatore. L’esposizione delle SH-SY5Y per 5 ore a diverse concentrazioni di t-BOOH (10µM, 30µM, 100µM) induce un danno dose-dipendente. E’ stata scelta, come dose da utilizzare nella successiva fase sperimentale, la concentrazione di t-BOOH 10µM che causa una mortalità cellulare prossima al 40%. Il trattamento con nicotina, alle concentrazioni di 10 e 100 μM, che in altri modelli sperimentali si erano dimostrate in grado di proteggere i neuroni da diversi tipi di danno non si traduce in un miglioramento della vitalità cellulare. Il condensato (CSC) è costituito da una miscela di 4.800 composti chimici che presentano attività genotossica e citotossica. In letteratura il CSC viene indicato come un agente pro–apoptotico in cellule polmonari. Poiché gli effetti a livello neuronale esercitati dal CSC non sono noti, lo scopo del nostro lavoro è stato quello di studiare gli eventuali effetti del CSC su cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y. E’ stata quindi preventivamente eseguita una dose-risposta del CSC, sottoponendo le cellule a concentrazioni basse di condensato, (0.1µg/ml-150µg/ml). L’effetto tossico esercitato dal condensato espresso come % della mortalità cellulare, è stato ottenuto valutando la sofferenza mitocondriale delle cellule mediante la metodica del test dell’1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan (MTT test). I risultati hanno dimostrato che il CSC è in grado di indurre apoptosi delle cellule neuronali. In particolare, la percentuale di mortalità delle cellule va dal 60% per esposizioni a concentrazioni di 50µg/ml, fino al 95-98% con concentrazioni di 150µg/ml. In virtù di quanto osservato, si è indagato sulle cause della morte cellulare e in particolare sulla capacità da parte del CSC di indurre la produzione dei radicali ossidrilici (ROS). I radicali liberi sono stati rilevati attraverso tecniche di microscopia a fluorescenza, trattando le cellule con un probe, la 2’-7’ diclorofluoresceina diacetato. Per revertire il danno prodotto da condensato, le cellule sono state trattate con una molecola scavenger di radicali liberi: la vitamina E. Le cellule sono state trattate con CSC alla dose di 50µg/ml, scelta sulla base della dose-risposta su riportata. La vitamina E è stata aggiunta in contemporanea al trattamento con CSC per 24 h ed è stata misurata la vitalità cellulare espressa con la metodica dell’MTT. Le cellule sono state trattate con vit.E (50µM) e con CSC (50µg/ml). La vitamina E si è dimostrata in grado di revertire il danno prodotto dal CSC.

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