Petraroli, Angelica (2006) Effetti immunomodulanti dell’istamina sulle cellule del sistema immunitario. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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L’istamina, sintetizzata dai mastociti e dai basofili umani, svolge un ruolo rilevante nella patogenesi delle reazioni infiammatorie e delle malattie allergiche. Essa può essere rilasciata da mastociti tessutali e basofili a seguito dell’attivazione da parte di molteplici stimoli immunologici e non-immunologici. L’istamina induce una serie di effetti immediati, quali vasodilatazione, aumentata permeabilità vascolare e broncocostrizione attraverso l’attivazione del recettore H1 presente sulle cellule muscolari lisce dei bronchi, e sulle cellule endoteliali. Inoltre, essa è in grado di modulare in maniera differenziale le funzioni di numerose cellule coinvolte nelle risposte infiammatorie ed immuni quali eosinofili, neutrofili, linfociti T, monociti, macrofagi e cellule dendritiche. Le risposte elicitate dall’istamina sono estremamente variabili, suggerendo che l’espressione dei recettori dell’istamina (H1, H2, H3 and H4) può essere differente tra cellule della linea monocito-macrofagiche. Lo scopo del nostro studio è stato quello di esaminare inizialmente gli effetti di concentrazioni fisiologiche di istamina sui macrofagi polmonari in vitro e successivamente confrontare l’espressione e l’attività funzionale del recettore H1 nei monociti del sangue periferico, nei macrofagi polmonari (HLM) e nei macrofagi derivati da monociti differenziati in vitro (MDM). Materiali e Metodi: I macrofagi polmonari (HLM) sono stati purificati dal tessuto di pazienti sottoposti a chirurgia toracica mediante gradiente discontinuo di Percoll. I monociti sono stati purificati dal sangue periferico di donatori sani mediante gradiente di densità e selezione immunomagnetica negativa. I macrofagi derivati da monociti (MDM) sono stati ottenuti incubando (7-10 giorni) i monociti con FCS. Le cellule sono state incubate (37°C, 2-18 ore) con concentrazioni crescenti di istamina, agonisti ed antagonisti recettoriali anti-H1 ed anti-H2. Al termine dell’incubazione è stata determinata la secrezione di β-glucuronidasi con tecnica colorimetrica, la produzione di IL-6 ed IL-8 con ELISA ed il calcio intracellulare con tecnica microfluorimetrica. L’espressione del recettore H1 è stata valutata mediante RT-PCR quantitativa e western blot. Risultati: L’istamina induce la secrezione di β-glucuronidasi e di IL-6 nei HLM in maniera concentrazione-dipendente con un massimo rilascio compreso rispettivamente tra 2 e 6 ore di incubazione. L’esocitosi e la secrezione di citochine proinfiammatorie indotte dall’istamina nei HLM sono Ca2+ dipendenti. Gli effetti dell’istamina sono inibiti da un antagonista recettoriale anti-H1 (fexofenadina), ma non dalla ranitidina (antagonista del recettore H2). Esperimenti successivi di PCR quantitativa hanno evidenziato che gli HLM e gli MDM esprimono rispettivamente livelli 3 e 15 volte più elevati di mRNA per l’H1 rispetto ai monociti. Il western blot conferma l’aumento dell’espressione della proteina del recettore H1 durante la differenziazione cellulare da monociti in macrofagi. Per verificare se il recettore overespresso nei macrofagi era funzionalmente attivo abbiamo valutato la secrezione di IL-8 indotta dall’istamina nei monociti e negli MDM. L’istamina induce la produzione di IL-8 in maniera concentrazione dipendente in entrambi i tipi cellulari. Questo effetto è significativamente maggiore negli MDM (aumento di 5,22,8 volte vs. controllo) rispetto a quello osservato nei monociti (aumento di 2,20,6 volte vs. controllo). La secrezione di IL-8 indotta dall’istamina viene inibita dalla levocetirizina (selettivo antagonista del recettore H1) in maniera concentrazione-dipendente con IC50 di 847304 nM. Viceversa, la ranitidina non influenza la secrezione indotta dall’istamina. L’istamina non è in grado di indurre alcun segnale del calcio nei monociti mentre negli MDM induce un significativo incremento del calcio intracellulare che viene completamente inibito dalla levocetirizina. Conclusioni: Questi risultati indicano che l’istamina è un efficace stimolo per l’esocitosi e per la produzione di citochine/chemochine nelle cellule della linea monocito-macrofagica. La differenziazione dei monociti in macrofagi, sia in vivo nel polmone che in vitro, si associa alla up-regolazione del recettore H1. L’aumento dell’espressione del recettore H1 è associato ad un incremento della risposta funzionale dell’istamina. Queste osservazioni suggeriscono che l’istamina può contribuire al mantenimento dell’infiammazione e al rimodellamento tessutale nelle malattie allergiche ed infiammatorie del polmone mediante la produzione di mediatori proinfiammatori ed immunomodulanti rilasciati dalle cellule monocito-macrofagiche, mediante la differente espressione del recettore H1 ed infine attraverso la diversa responsività di tali cellule all’istamina stessa.

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