Gianni, Davide (2006) Studio della regolazione della maturazione proteolitica del precursore del peptide β amiloide APP. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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[ITALIANO] Il peptide β amiloide presente nelle placche senili nella malattia di Alzheimer deriva dal taglio della proteina di membrana APP. In questo lavoro di tesi e’ stato sviluppato un sistema sperimentale per identificare possibili segnali extracellulari capaci di indurre il taglio della proteina di fusione APP-Gal4; tale taglio e’ rilevato misurando l’espressione del gene CAT trascritto sotto il controllo del fattore trascrizionale di lievito Gal4, che viene rilasciato dalla membrana dopo il taglio di APP-Gal4. Utilizzando tale saggio, e’ stato possibile purificare una proteina dal mezzo condizionato delle C6 che attiva il taglio di APP-Gal4 e che e’ stato dimostrato essere il PDGF-BB. E’ stato inoltre dimostrato che il taglio proteolitico di APP-Gal4 indotto dal PDGF e’ dipendente dall’attivita’ della γ secretasi ed e’ dipendente dall’attivazione della protein chinasi Src e della small GTP binding protein Rac1. Inoltre e’ stato valutato anche il coinvolgimento dei ligandi del dominio intracellulare di APP nel taglio di APP-Gal4 indotto dal PDGF. Utilizzando sempre lo stesso saggio e’ stato dimostrato quindi che l’overespressione di Fe65 attiva il taglio di APP-Gal4 mentre quella di X11 lo stabilizza. L’analisi delle mutazioni puntiformi del dominio YENPTY di APP indica che Fe65 ed il PDGF agiscono con differenti meccanismi nell’indurre il taglio di APP-Gal4. Infatti, Fe65 necessita dell’integrita’ del residuo di tirosina in posizione 682 di APP mentre l’effetto del PDGF e’ dipendente dall’integrita’ dell’asparagina in posizione 684. Inoltre la mutazione dell’aspartato in posizione 664, che e’ il sito bersaglio per il taglio di APP dipendente da caspasi 3, diminuisce fortemente l’effetto di Fe65 sul taglio di APP-Gal4. Questo suggerisce che Fe65 attiva il taglio di APP-Gal4 attraverso la caspasi-3 ed infatti l’inibitore di tale caspasi e’ in grado di abolire l’effetto di Fe65. / [ENGLISH] The -amyloid peptide (A) present in the senile plaques of Alzheimer’s disease derives from the cleavage of a membrane protein, named APP. We have developed an experimental system to identify possible extracellular signals able to trigger the cleavage of an APP-Gal4 fusion protein, which is detected by measuring the expression of the CAT gene transcribed under the control of the Gal4 transcription factor, which is released from the membrane upon the cleavage of APP-Gal4. By using this assay, we purified a protein contained in the C6 cell conditioned medium, which activates the cleavage of APP-Gal4 and which we demonstrated to be PDGF-BB. The APP-Gal4 processing induced by PDGF is dependent on the -secretase activity, and is the consequence of the activation of a pathway downstream of the PDGF-receptor, which includes the non-receptor tyrosine kinase Src and the small G-protein Rac1. By using an APP-Gal4 reporter system, we observed that the overexpression of Fe65 activates APP-Gal4 cleavage, whereas X11 stabilizes APP. The analysis of point mutations of the APP YENPTY motif indicates that Fe65 and PDGF function through different mechanisms. In fact, Fe65 requires the integrity of APP695 Tyr682 residue, whereas PDGF effect is dependent upon the integrity of Asn684. Furthermore, the mutation of Asp664 of APP, which is the target site for the caspase-directed APP cleavage, strongly decreases the effect of Fe65. This suggests that Fe65 activates the cleavage of APP by caspases, and in fact, caspase inhibitor Z-VEVD decreases the APP cleavage induced by Fe65.

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