Sica, Raffaella (2015) Effetti del pesticida 2,2-Bis(4-Clorofenil)-1,1-Dicloroetilene (DDE) sulla morfologia, funzionalità e dinamica mitocondriale nel testicolo e nel fegato di ratto. [Tesi di dottorato]

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Item Type: Tesi di dottorato
Lingua: Italiano
Title: Effetti del pesticida 2,2-Bis(4-Clorofenil)-1,1-Dicloroetilene (DDE) sulla morfologia, funzionalità e dinamica mitocondriale nel testicolo e nel fegato di ratto
Creators:
CreatorsEmail
Sica, Raffaellaraffaella.sica@unina.com
Date: 31 March 2015
Number of Pages: 149
Institution: Università degli Studi di Napoli Federico II
Department: Biologia
Scuola di dottorato: Scienze biologiche
Dottorato: Biologia avanzata
Ciclo di dottorato: 27
Coordinatore del Corso di dottorato:
nomeemail
Gaudio, Lucianoluciano.gaudio@unina.it
Tutor:
nomeemail
Putti, RosalbaUNSPECIFIED
Date: 31 March 2015
Number of Pages: 149
Uncontrolled Keywords: mitocondri, pesticidi, DDE, fegato, testicolo, morfologia mitocondriale, bulging, funzionalità mitocondriale, dinamica mitocondriale, OPA1, Mfn2, Drp1, citocromo c, apoptosi, Chop/Gadd153.
Settori scientifico-disciplinari del MIUR: Area 05 - Scienze biologiche > BIO/06 - Anatomia comparata e citologia
Aree tematiche (7° programma Quadro): SALUTE e TUTELA DEL CONSUMATORE > Biotecnologie, strumenti e tecnologie generiche per la salute umana
BIOTECNOLOGIE, PRODOTTI ALIMENTARI E AGRICOLTURA > Scienze della vita, biotecnologia e biochimica per prodotti e processi non-alimentari sostenibili
Date Deposited: 07 Apr 2015 13:50
Last Modified: 05 May 2016 01:00
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/10406
DOI: 10.6092/UNINA/FEDOA/10406

Abstract

Il 2,2-Bis(4-Clorofenil)-1,1-Dicloroetilene (DDE), è il principale metabolita prodotto dalla degradazione del DDT e presenta un'elevata liposolubilità, una scarsa idrosolubilità e una grande resistenza alla fotossidazione, caratteristiche che lo rendono molto stabile e persistente nell'ambiente e che gli permettono di avere un'elevata capacità di bioaccumulo. Infatti nonostante nei paesi occidentali DDT e DDE siano stati banditi da molti anni, il DDE in particolare si ritrova ancora nei tessuti grassi degli organismi, uomo compreso. Gli effetti del DDE si evidenziano a livello del tessuto nervoso, delle ghiandole endocrine, del fegato e dell'apparato riproduttore. In questo studio l'attenzione è stata focalizzata sul fegato e sul testicolo di ratti. In particolare, dal momento che il DDT ed il DDE agiscono a livello mitocondriale, presumibilmente agendo come disaccoppianti, nel mio progetto di ricerca ho deciso di utilizzare i mitocondri come possibili biomarkers del danno tossico da pesticidi e chiarire il meccanismo tramite il quale il DDE può eventualmente indurre danno a livello mitocondriale e cellulare. Sono stati scelti i mitocondri epatici poichè il fegato è l'organo deputato, fra l'altro, ai processi di detossificazione e quelli del testicolo dal momento che i pesticidi hanno effetto anti-androgenico e che nei mitocondri avviene la prima tappa del processo di steroidogenesi. Ho valutato gli effetti del DDE sulla bioenergetica mitocondriale ed ho verificato le possibili variazioni delle proteine della dinamica mitocondriale, un campo di studi che negli ultimi quindici anni ha avuto un forte impulso, considerate le strette interrelazioni fra dinamica e funzionalità mitocondriale. Ho, altresì, seguito al microscopio elettronico le eventuali alterazioni ultrastrutturali di questi organelli causate dalla somministrazione del DDE. Il protocollo sperimentale ha previsto di valutare sia gli effetti acuti con una forte dose di DDE, sia quelli cronici con somministrazioni di dosi minime e continue, come avviene per gli organismi viventi nell'ambiente naturale. L'effetto acuto è stato valutato su mitocondri di fegato isolati a cui in vitro è stata somministrata una dose di DDE di 157 nmol/mg proteina. Gli studi in vivo ed ex vivo (con l'isolamento dei mitocondri dei ratti in studio) sono stati eseguiti sul fegato e sul testicolo di ratti Wistar alimentati con differenti tipi di diete per un periodo di 4 settimane. L'uso di differenti diete è stato pensato per valutare l'impatto del DDE, molto liposolubile, associato a diete iperlipidiche. Le diete sono state le seguenti: standard di laboratorio N, ricca in lardo D, con l'aggiunta di DDE alle stesse (N+DDE, D+DDE). La dose di DDE utilizzata per gli studi in vivo è stata di 10 mg/kg di peso corporeo dell'animale. Gli studi in vitro sui mitocondri epatici mostrano una significativa diminuzione delle capacità respiratorie, danneggiando sia la via respiratoria NADH-linked che FADH2-linked, una ridotta capacità di ossidare gli acidi grassi e un severo danno all'integrità dei mitocondri. Il trattamento cronico ex vivo con dosi basse di DDE provoca un adattamento funzionale nei ratti trattati. I mitocondri, infatti, presentano un aumento della capacità di ossidare acidi grassi; ciononostante si può rilevare mediamente un modesto danno all'integrità mitocondriale come indicato dall'abbassamento dell'RCR. Altro aspetto è l'aumento dello stress ossidativo, con aumento dell'H2O2 e dei perossidi lipidici nei trattati con DDE. Per quanto concerne l'effetto del DDE sulla dinamica e sulla morfologia mitocondriale, è noto ormai che i mitocondri sono organelli dinamici, la cui forma e dimensioni, lunghezza e numero sono variabili e controllati dai processi di fissione e fusione. Questi due processi sono regolati da grandi GTPasi che sono rispettivamente Mfn1 e 2 ed OPA1 per la fusione delle membrane mitocondriali esterne ed interne, e Drp1 e Fis1 per la fissione mitocondriale. Lo studio delle proteine della dinamica, tramite western blot, evidenzia che esse variano negli animali trattati sia con semplice dieta iperlipidica che con DDE, rispetto ai ratti di controllo. In particolare, nella sola dieta iperlipidica si nota un aumento di Drp1 ed una diminuzione della Mfn2, il che sta ad indicare uno spostamento verso il processo di fissione che quindi prevale sulla fusione. A livello morfologico si nota un maggior numero di mitocondri piccoli, circolari rispetto ai tubulari più lunghi. Nei trattati con DDE (D+DDE e N+DDE) aumentano sia Drp1 sia Mfn2 ad indicare che in questi animali, c'è una maggiore biogenesi mitocondriale, probabilmente come meccanismo adattativo per riparare i danni indotti dal pesticida: i mitocondri si frammentano per eliminare parti danneggiate e si fondono con altri mitocondri per recuperare molecole perdute. A livello ultrastrutturale si notano varie forme di alterazioni dei mitocondri nei ratti D+DDE e N+DDE: mitocondri donut, che si formano in condizioni di stress ossidativo e mitocondri con processi di bulging, cioè erniazioni che vengono interpretate come immagini testimonianti l'apertura del poro di transizione di permeabilità. La proteina OPA1 oltre ad intervenire nel processo di fusione mitocondriale, è implicata anche nel rimodellamento delle creste, processo indipendente da quello della fusione. Studi recenti hanno evidenziato la presenza di diverse isoforme di OPA1, fra cui OPA1-L (100 KDa) intramembrana e la forma solubile OPA1-S (80 KDa), che formano un complesso oligomerico legato alla membrana mitocondriale interna (m.m.i.) a livello delle giunzioni delle creste che è in grado di tenere chiuse le creste. Western blot, per OPA1, nel fegato, mostrano come ci sia una diminuzione di OPA1-L negli animali trattati col DDE rispetto agli animali N, e come a questo corrisponda un aumento di OPA1-S (80 KDa) rispetto ai controlli. In condizioni normali l'oligomero di OPA1 tiene chiuse le giunzioni e tiene prigioniero all'interno delle creste il citocromo c. I western blot da me allestiti mostrano una diminuzione di citocromo c mitocondriale negli animali trattati col DDE alla quale corrisponde un aumento di cit.c citosolico, probabilmente dovuto al forte stress ossidativo provocato dal DDE che causa la disoligomerizzazione di OPA1 e l'apertura delle creste. Generalmente questi eventi innescano, poi, il processo di apoptosi. Tramite real time PCR e western blot ho valutato l'espressione di un marker più tardivo dell'apoptosi, Chop/Gadd153. I risultati ottenuti mostrano un aumento sia del messaggero che della proteina negli animali trattati con il DDE. Infine, per quanto riguarda il testicolo, come per il fegato, ho valutato le capacità respiratorie dei mitocondri isolati relative allo stato 4 (in assenza di ADP), allo stato 3 (in presenza di ADP) ed il rapporto di controllo respiratorio o RCR (dato dal rapporto stato3/stato 4), indice di integrità dei mitocondri. I risultati ottenuti mostrano che dopo 4 settimane di trattamento non si ha nessuna variazione significativa dello stato 4 della respirazione in presenza di piruvato, come substrato, anche se si osserva una tendenza alla diminuzione nei due gruppi di ratti trattati con DDE. Per quanto riguarda lo stato 3 si osservano invece delle variazioni significative tra i gruppi sperimentali. In particolare si osserva una diminuzione significativa della respirazione in stato 3 in entrambi i gruppi trattati con DDE. Anche l'indice di integrità mitocondriale RCR, è diminuito in entrambi i gruppi trattati con il DDE. I risultati sulle proteine della dinamica mitocondriale in parte ricalcano quelli ottenuti nel fegato. Anche per OPA1, si evidenzia una diminuzione dell'isoforma lunga OPA1-L, un aumento dell'isoforma corta OPA1-S ed un aumento correlato di citocromo c citosolico. Il dosaggio dei livelli di testosterone con il metodo Elisa indica che essi si riducono negli animali trattati col DDE, confermando il ruolo anti-androgenico del pesticida. Da questo mio studio emerge che la dose di pesticida a cui l'animale è sottoposto è molto importante perché dosi alte danneggiano seriamente la funzionalità e l'integrità dei mitocondri, dosi basse, almeno per il periodo di tempo da me saggiato, sono abbastanza tollerate, causando un adattamento funzionale dei mitocondri che rispondono con un aumento della biogenesi. In questo contesto anche l'aumento dell'apoptosi sembra rientrare nel meccanismo di adattamento che tende ad eliminare le cellule seriamente danneggiate ripristinando fin quando possibile l'omeostasi tissutale.

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