Florio, Giovanni (2006) Attivazione dei Basofili e dei Mastociti Umani da parte delle Glicoproteine gp120 e gp41 e di Tat del Virus HIV-1. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Item Type: Tesi di dottorato
Uncontrolled Keywords: AIDS, HIV, Basofili, Mastociti, Citochine, Chemochine
Date Deposited: 31 Jul 2008
Last Modified: 30 Apr 2014 19:24
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/1086

Abstract

La glicoproteina gp120 ottenuta da diverse cladi del virus HIV-1 è un potente attivatore della secrezione di interleuchina 4 (IL-4) e interleuchina 13 (IL-13) dai basofili purificati dal sangue periferico di donatori sieronegativi per anticorpi anti-HIV-1 ed anti-HIV-2. L’incubazione con gp120 aumenta l’espressione di RNA messaggero per IL-4, costitutivamente presente nei basofili umani. L’attivazione indotta da gp120 viene inibita dalla preincubazione dei basofili con ciclosporina A e tacrolimus. La cinetica della secrezione di IL-4 indotta dalla gp120 è sovrapponibile a quella indotta da un anticorpo monoclonale anti-IgE umane. Diversi tipi di gp120 inducono la secrezione di istamina dai basofili e dai mastociti umani isolati da parenchima polmonare. La rimozione delle IgE di membrana, attraverso una breve incubazione dei basofili o dei mastociti con acido lattico, abolisce la risposta di queste cellule alla gp120 e all’anticorpo anti-IgE. La preincubazione di gp120 con IgM monoclonali umane VH3+, ma non con IgM monoclonali VH6+, inibisce la secrezione di IL-4. La preincubazione dei basofili con peptidi sintetici che riproducono sequenze distanti dall’estremo carbossi- ed amino-terminale della struttura primaria della gp120 inibiscono la secrezione di IL-4 indotta da gp120. Questi risultati dimostrano che la gp120 agisce come un superantigene virale interagendo con la regione VH3+ delle IgE di membrana delle cellule FcεRI+. La sintesi di IL-4 e IL-13 dai basofili e dai mastociti umani potrebbe svolgere un ruolo importante nella replicazione di HIV-1 e nella progressione dell’AIDS. Molteplici studi indicano, inoltre, che gp41 esercita diversi effetti sul sistema immunitario. In particolare è stato dimostrato che la forma solubile della gp41 induce la sintesi di citochine proinfiammatorie (TNF e IL-1) (Merrill et al., 1992; Takeshita et al., 1995) ed aumenta l’attività dell’ossido nitrico sintetasi nei fagociti mononucleati e nelle cellule della microglia (Adamson et al., 1996). Inoltre è stato dimostrato che la gp41 è in grado di sopprimere la proliferazione dei linfociti (Chen et al., 1995) e di favorire la risposta immune di tipo TH2 inducendo preferenzialemente la produzione di IL-10 nei monociti (Koutsonikolis et al., 1997). Molteplici evidenze indicano che la gp41 è un potente agente chemiotattico per i monociti e per i neutrofili mediante l’interazione con una famiglia di recettori accoppiati a proteine G e specifici per un tripeptide formilato (N-formyl-metionil-leucil-fenilalanina, FMLP) (Su et al., 1999; Su et al., 1999a). Diversi peptidi N-formilati, incluso l’FMLP, sono stati purificati da sovranatanti di colture batteriche, suggerendo che essi interagiscono con recettori espressi sulle cellule infiammatorie. FMLP attiva dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline costituiti da sette domini transmembrana ed accoppiati a proteine G. Sono stati identificati e clonati tre recettori appartenenti a questa famiglia diversamente espressi sui leucociti umani. I neutrofili esprimono il recettore ad alta affinità (FPR) e il suo omologo FPR-like 1 (FPRL1) mentre i monociti esprimono FPR, FPRL-1 e FPR-like 2 (FPRL2) (Durstin et al., 1994). FPR è il recettore ad alta affinità per l’FMLP; viceversa FPRL-1 ha una affinità minore (Gao et al., 1994). FPRL-1 è un recettore promiscuo attivato dall’amiloide A (Su et al., 1999b), dalla lipossina A4 (Fiore et al., 1994) e da molteplici peptidi di sintesi (Christophe et al., 2001). La ciclosporina H e la spinorfina sono specifici antagonisti del recettore FPR (de Paulis et al., 1996; Wenzel-Seifert et al., 1998; Liang et al., 2001) e inibiscono la chemiotassi dei basofili indotta da FMLP. Nessun agonista naturale di FPRL-2 è stato identificato. Sono stati, dunque, valutati gli effetti dei peptidi sintetici (2017, 2019, 2020, 2021, 2023, 2027, 2029, 2030, 2031e 2035) costituenti l’envelope di gp41 di HIV-1MN sulla attivazione dei basofili umani. In una prima serie di esperimenti condotti con la metodica della RT-PCR abbiamo verificato l’espressione dell’mRNA per FPR, FPRL1 e FPRL2 nei basofili umani isolati dal sangue periferico di donatori sani. In una seconda serie di esperimenti, utilizzando agonisti specifici dei recettori formilati, abbiamo valutato l’espressione funzionale degli stessi recettori. Successivamente, abbiamo valutato l’attività chemiotattica, la sintesi e il rilascio di mediatori preformati e citochine proinfiammatorie dalle cellule FcRI+ indotta dai peptidi della gp41. Oltre all’effetto citopatico diretto che il virus HIV-1 esercita sulle cellule infettate, alcune proteine virali possono essere coinvolte nel determinare la grave immunodeficienza dei pazienti affetti da AIDS. Tat, la proteina transattivatrice del virus HIV-1, ha attratto l’interesse di numerosi gruppi di ricerca. Essa esercita un ruolo importante sia nell’espressione genica virale che nella replicazione e nel controllo dell’infezione ed è anche in grado di trans-attivare geni eterologhi cellulari e virali (Gaynor, 1995). E’ stato dimostrato che mutanti di Tat nella regione ricca di cisteina inibiscono l’espressione dei geni dell’HLA di classe II nei macrofagi e nelle cellule T (Tosi et al., 2000). Inoltre, la proteina Tat è secreta negli spazi extracellulari dalle cellule infettate da HIV-1 (Ensoli et al., 1990; Westendorp et al., 1990; Helland et al., 1991) e può essere captata dalle altre cellule (Frankel and Pabo, 1991) nelle quali è in grado di riattivare un’infezione latente (Helland et al., 1991). E’ ormai evidente che Tat può modificare le funzioni di cellule non infettate con un meccanismo paracrino. Ad esempio, Tat stimola la chemiotassi dei monociti umani (Lafrenie et al., 1996; Albini et al., 1998), delle cellule dendritiche (Benelli et al., 1998) ed è un potente fattore angiogenico in grado di stimolare la migrazione delle cellule endoteliali (Albini et al., 1996). Queste attività potrebbero essere mediate dall’interazione con l’integrina ab5 (Lafrenie et al., 1996; Vogel et al., 1993), con il recettore Flk-1 (Mitola et al., 1998) o con i recettori per le chemochine CCR2 e CCR3. I basofili umani esprimono, inoltre, il recettore per chemochine CCR3 che è attivato dalla eotassina e da RANTES (Uguccioni et al., 1997). Recenti studi hanno dimostrato che il recettore CCR3 è anche espresso sui mastociti umani presenti nell’intestino, nella cute, e nei polmoni (Ochi et al., 1999; Romagnani et al., 1999). L’eotassina e RANTES rappresentano importanti stimoli chemiotattici anche per i mastociti tessutali (Romagnani et al., 1999). Queste cellule esercitano un ruolo importante nella risposta dell’ospite agli agenti infettivi (Malaviya et al., 1996., Prodeus et al., 1997; Patella et al., 2000). In questo studio abbiamo valutato l’ipotesi che la proteina Tat del virus HIV-1 possa stimolare la chemiotassi e la mobilizzazione di Ca++ intracellulare dei basofili e dei mastociti umani. Abbiamo osservato che la chemiotassi delle cellule FcRI+ indotta da Tat è inibita dalla preincubazione dei basofili con un anticorpo monoclonale diretto contro CCR3 o da un anticorpo contro un epitopo della proteina Tat. Abbiamo inoltre verificato che Tat induce l’espressione di CCR3 sulle cellule FcRI+. I risultati di queste esperienze dimostrano che Tat induce la chemiotassi di basofili e mastociti umani e che questa attività è mediata dall’interazione con il recettore CCR3.

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