Manganiello, Gelsomina (2016) PRODUZIONE DI NUOVI CEPPI DI TRICHODERMA SPP. CON CARATTERISTICHE BENEFICHE MULTIPLE. [Tesi di dottorato]

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Tipologia del documento:	Tesi di dottorato
Lingua:	Italiano
Titolo:	PRODUZIONE DI NUOVI CEPPI DI TRICHODERMA SPP. CON CARATTERISTICHE BENEFICHE MULTIPLE
Autori:	Autore Email Manganiello, Gelsomina gelsomina.manganiello@unina.it
Data:	31 Marzo 2016
Numero di pagine:	227
Istituzione:	Università degli Studi di Napoli Federico II
Dipartimento:	Agraria
Scuola di dottorato:	Scienze agrarie e agro-alimentari
Dottorato:	Agrobiologia e agrochimica
Ciclo di dottorato:	28
Coordinatore del Corso di dottorato:	nome email Carputo, Domenico carputo@unina.it
Tutor:	nome email Lorito, Matteo [non definito]
Data:	31 Marzo 2016
Numero di pagine:	227
Parole chiave:	Trichoderma, trascrittomica, biocontrollo
Settori scientifico-disciplinari del MIUR:	Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/12 - Patologia vegetale
Depositato il:	13 Apr 2016 14:35
Ultima modifica:	09 Nov 2016 10:02
URI:	http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/11052

Abstract

L’analisi Microarray è stata utilizzata per studiare l’espressione genica in pomodoro (Solanum lycopersicum cv Microtom) durante l’interazione con il T. harzianum ceppo M10 o il suo metabolita secondario acido harzianico (HA), in presenza-assenza del patogeno R. solani. I diversi trattamenti effettuati sulle piante con l’agente di biocontrollo, il metabolita secondario e il patogeno hanno permesso di individuare cambiamenti nell’espressione genica sia nell’interazione a due che a tre componenti. Nel caso dell’interazione bipartita, il numero dei DEG (Differentially Expressed Genes) è risultato maggiore nel confronto Pianta-M10 vs Controllo; difatti sono stati identificati 1308 DEGs (1214 up-regulated e 94 down-regulated), mentre nel confronto Pianta-HA vs Controllo è stato annotato un unico gene differenzialmente espresso, risultato sotto regolato. In seguito al trattamento con T. harzianum ceppo M10, la pianta ha mostrato una sovra-espressione di geni coinvolti in processi di glicolisi, TCA e fotosintesi, oltre alla sovra-espressione di geni quali estensina, XTH, NAC e COP9 che sono generalmente associati ai meccanismi di crescita e sviluppo della pianta, suggerendo quindi una capacità del fungo di stimolare tali processi. Lo stesso trattamento ha mostrato una sovra-espressione di alcuni geni codificanti per chitinasi, ovvero enzimi classificati come proteine di patogenesi (PR). Nell’interazione tripartita, in presenza del patogeno Rhizoctonia, il numero di geni differenzialmente espressi è risultato maggiore rispetto all’interazione bipartita. Molti di questi DEG sono risultati coinvolti in molteplici risposte di difesa. Analizzando il confronto pianta infetta-M10 vs Pianta infetta, sono stati individuati 1218 DEG, dei quali 661 sovra-espressi e 557 sotto-espressi; nel trattamento pianta infetta-HA vs Pianta infetta sono stati identificati 2507 DEGs, di cui 1517 sovra-espressi e 990 sotto-espressi. Nel confronto tra i trattamenti Pianta-HA-R. solani vs Pianta-M10-R. solani non sono stati identificati geni differenzialmente espressi. I trattamenti con Trichoderma sembrano avere un’azione protettiva sulla pianta ospite mostrata dalla sovra-espressione di geni in grado di detossificare i composti ROS che, se accumulati, possono danneggiare ed essere tossici nelle cellule vegetali. In accordo con i risultati dell’interazione bipartita Pianta-Trichoderma, sono stati identificati geni codificanti per le proteine “Multi bridgingfactor 1”, ER-24 e EIN3 che indicano la presenza dell’ormone etilene e, la concomitante attivazione della via dell’acido jasmonico, suggerendo quindi un effetto sui meccanismi di resistenza (ISR). La presenza di Trichoderma, ha un effetto sull’espressione di geni coinvolti nel processo di difesa della pianta, sia essa sana (priming), sia soggetta all’attacco di un patogeno. Questo studio ha fornito indicazioni importanti sull’effetto positivo che l’agente di biocontrollo e il suo metabolita esplicano sulla promozione della crescita e attivazione delle risposte di difesa in pomodoro. Brachypodium distachyon è una pianta che appartiene alla classe delle monocotiledoni, famiglia Poaceae, che comprende le colture di maggior interesse commerciale per la produzione agricola, come i cereali: frumento, mais e riso. B. distachyon viene proposta come coltura alternativa a Panicum virgatum, per la produzione di biocarburanti. Gli studi dell’interazione B. distachyon-microrganismi benefici potrebbero fornire indicazioni importanti per una produzione sostenibile di bioenergia grazie ad un aumento della biomassa vegetale e della resistenza a stress. Poiché non sono ancora noti in letteratura studi che riguardano il sistema Brachypodium-Trichoderma ed i risultati possono variare enormemente a seconda della specie vegetale, del ceppo o dei parametri utilizzati nei trattamenti, una prima fase del lavoro ha riguardato la definizione delle condizioni ottimali per lo svolgimento delle successive sperimentazioni che hanno riguardato il trattamento preliminare dei semi, la scelta del tipo di suolo su cui effettuare i saggi, la tipologia di accessione da utilizzare. Analogamente sono state selezionate diverse specie di Trichoderma, isolate da molteplico formulati commerciali registrati come biofungicidi e/o biofertilizzanti. Da uno screening preliminare sono stati selezionati 3 ceppi (M10, Myc1 e RS2, tutti appartenenti alla specie T. harzianum) che hanno evidenziato la migliore attività in termini di incremento della crescita e di biomassa vegetale in B. dystachion. Dal momento che, per la produzione di bioenergia è necessario impiegare la parte epigea della pianta, la selezione dei ceppi e le analisi che sono seguite si sono concentrate soprattutto sui trattamenti in grado di determinare un maggior incremento del peso secco dell’apparato fogliare delle piante trattate. Una prima considerazione emersa dall’osservazione dei risultati ottenuti in questo lavoro è che la specie T. harzianum ha mostrato un’attività ospite-specifica nei confronti di B. dystachion rispetto alle altre 3 specie di Trichoderma impiegate. Questa ipotesi trova conferma in letteratura dove viene riportato che esiste una componente genetica della pianta che può influenzare l’effetto del ceppo (Shoresh e Harman, 2008). Per quanto riguarda le modalità di trattamento dei semi con i ceppi selezionati, la sola concia ha determinato un notevole incremento del peso fresco delle piante trattate rispetto al controllo. Inoltre non è stato osservato alcun effetto di promozione della crescita dovuto al trattamento dei semi con miscele di spore sterilizzate (e quindi non più vitali), indicando che l’effetto positivo sulle piante è dovuto al BCA vivente. L’isolamento e la determinazione della concentrazione degli endofiti presenti a livello radicale ha inoltre mostrato un buon livello di colonizzazione da parte dei ceppi di Trichoderma applicati sulla pianta ospite. Ad ogni modo, quando al trattamento al seme seguivano trattamenti settimanali al suolo con le sospensioni di spore dei ceppi selezionati, gli incrementi del peso fresco delle piante rispetto al controllo sono stati di gran lunga maggiori. Le performance dei ceppi sono state monitorate a cadenza settimanale e in diversi casi sono stati riscontrati incrementi di peso superiori al 100% rispetto ai controlli. Particolarmente interessante è risultato l’incremento del peso secco nelle piante dopo due settimane dal trattamento con il ceppo M10 rispetto al controllo (+124% con la sola concia del seme, e +225% con la concia seguita dagli inoculi settimanali). Questi dati trovano conferma negli innumerevoli studi presenti in letteratura circa la capacità di Trichoderma di migliorare la crescita delle piante attraverso una serie di meccanismi (incremento della solubilizzazione dei nutrienti presenti nel suolo e della capacità della pianta di assorbirli, stimolazione della crescita dell’apparato radicale, cambiamento della composizione della microflora radicale, etc.). In conclusione i risultati ottenuti dallo studio dell’interazione Brachypodium-Trichoderma dimostrano come l’utilizzo di ceppi selezionati di questi funghi benefici possa rappresentare una valida strategia da utilizzare per promuovere la crescita e lo sviluppo di questa coltura utilizzata per produzione di bioenergia. Con la stessa finalità è stata utilizzata una strategia innovativa basata sull’ottenimento di nuovi ceppi ibridi di Trichoderma a partire da parentali selezionati sulla base di riconosciute proprietà benefiche nei confronti delle piante. Nello specifico sono stati selezionati tre BCA appartenenti alle specie T. harzianum (ceppo M10), T. longibrachiatum (ceppo MK1) e T. atroviride (ceppo P1), dotati di capacità di: antagonismo contro patogeni terricoli e fogliari; produzione di metaboliti secondari attivi; promozione della crescita delle piante; ed induzione di resistenza sistemica. Gli ibridi ottenuti mediante la fusione dei protoplasti di coppie di ceppi selezionati hanno mostrato in diversi casi un potenziamento della stimolazione della crescita delle piante o dell’attività di biocontrollo di patogeni rispetto ai ceppi parentali. I risultati più significativi si sono registrati in termini di allungamento radicale e crescita dell’apparato epigeo delle piante di pomodoro, mentre solo un ibrido selezionato ha determinato un anticipo della germinazione dei semi risultato statisticamente significativo rispetto ai parentali e al controllo. Tutti i ceppi impiegati hanno mostrato capacità di biocontrollo nei confronti del patogeno terricolo S. rolfsii e di quello fogliare B. cinerea e in taluni casi la capacità di inibizione dell’infezione dei ceppi derivati da fusione è risultata superiore a quella dei rispettivi parentali. Questo approccio impiegato per la produzione di ceppi ibridi rappresenta un’assoluta novità poiché non prevede la mutagenesi dei ceppi impiegati come parentali ed è in grado di combinare diversi caratteri desiderabili in un unico individuo.

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