Roselli, Rosalinda (2023) La modulazione dei recettori GPBAR1 e CysLT1R evidenzia il ruolo meccanicistico degli acidi biliari e dei leucotrieni nelle malattie metaboliche ed infiammatorie del fegato. [Tesi di dottorato]

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Abstract

Attualmente, i recettori accoppiati a proteine G (G protein-coupled receptor, GPCR) sono il bersaglio molecolare di ≈ il 40% dei farmaci commercializzati e rappresentano le strutture più studiate per sviluppare nuove terapie. I recettori accoppiati a proteine G costituiscono una grande famiglia di recettori, a sette eliche transmembrana, che media una grande varietà di processi cellulari. Il recettore degli acidi biliari GPBAR1 (G-protein-coupled bile acid receptor 1) e i recettori dei cisteinil-leucotrieni (Cysteinyl leukotriene receptors, CysLTRs) sono parte di questa famiglia e sono distribuiti in diversi tipi cellulari. Essi risultano coinvolti nella regolazione di numerosi processi fisiologici e patologici. La loro modulazione, perciò, può avere potenziali applicazioni terapeutiche per un ampio spettro di malattie. Nel dettaglio, GPBAR1 è ampiamente espresso in cellule del sistema immunitario innato quali macrofagi tissutali, incluse le cellule di Kupffer (KC, macrofagi residenti nel fegato), monociti circolanti, cellule dendritiche (DC) ed NKT, ma anche in cellule non immunitarie quali cellule stellate epatiche (HSC), cellule endoteliali sinusoidali (LSEC), colangiociti, cellule epiteliali intestinali, cellule nervose e cellule adipose brune. In generale, nelle cellule immunitarie GPBAR1 esercita una forte azione immunomodulatoria, promuovendo la loro polarizzazione verso un fenotipo antinfiammatorio, con conseguente riduzione dell'espressione e della secrezione di citochine e chemochine proinfiammatorie. Inoltre determina una modulazione negativa di NF-κB, un fattore di trascrizione che induce l’espressione di geni responsabili della produzione di proteine proinfiammatorie, determinando quindi una riduzione del rilascio di citochine come IL-6, IL-8 e TNF-α. Nelle LSEC l’attivazione di GPBAR1 è responsabile di un aumento dell’attività dell’enzima eNOS che protegge l’endotelio epatico dallo stress ossidativo e dalla perossidazione dei lipidi, suggerendo il coinvolgimento del recettore nella regolazione del microcircolo epatico. Nelle cellule enteroendocrine di tipo L induce invece la secrezione dell'ormone glucagone simile (GLP-1) che, interagendo con recettori delle cellule pancreatiche, determina un aumento dei livelli di cAMP (Cyclic adenosine monophosphate) e di ioni Ca++ intracellulari, favorendo il rilascio di insulina e regolando dunque i livelli ematici di glucosio e conseguentemente la glicemia post prandiale. Il recettore è anche coinvolto nella regolazione del dispendio energetico con aumento del metabolismo basale, risultando preventivo per obesità e insulino-resistenza. Questo avviene mediante la sua attivazione nei tessuti metabolici (tessuto adiposo bruno e muscolo scheletrico) con conseguente induzione dell’enzima iodotironina deiodinasi (D2), responsabile della conversione della forma inattiva dell’ormone tiroideo T4 nella sua forma attiva T3, che porta di conseguenza ad un aumento della fosforilazione ossidativa nei mitocondri e dunque ad un maggiore dispendio energetico. Infine analogamente al recettore nucleare degli acidi biliari FXR (Farnesoid-X-receptor), il recettore GPBAR1 regola l’omeostasi degli acidi biliari e del colesterolo mediante l'inibizione della sintesi di acidi biliari nel fegato e il loro recupero dalle vie biliari, aumentando l’associazione di colesterolo in LDL (Low-density lipoprotein) anziché in HDL (High-density lipoprotein) e riducendo l’accumulo di trigliceridi nel fegato e nel circolo ematico. Data la moltitudine di effetti derivanti dalla sua attivazione, si evince come GPBAR1 possa rappresentare un interessante target terapeutico oltre che per patologie infiammatorie e immunitarie, anche per malattie metaboliche come aterosclerosi, obesità, iperglicemia e steatosi epatica. I più potenti agonisti endogeni identificati per il recettore GPBAR1 sono gli acidi biliari secondari e i loro derivati tauro- e glico- coniugati. Considerati gli effetti benefici dati dall’attivazione di GPBAR1, la manipolazione chimica degli acidi biliari (BA), utilizzata con l'intento di migliorarne la potenza, l'efficacia e la stabilità metabolica, recentemente ha portato all’identificazione di molti composti con promettenti profili farmacologici. L’introduzione, ad esempio di un gruppo metile in posizione C-23 nella catena laterale dell’acido 6-etilchenodesossicolico (6-ECDCA) ha portato alla sintesi dell’INT-777, un potente agonista selettivo di GPBAR1, considerato promettente nel trattamento del diabete mellito di tipo 2. Successive modifiche nella lunghezza della catena laterale e nella natura del gruppo terminale sullo scaffold dell’acido biliare hanno portato alla sintesi del composto BAR501, il primo esempio di un derivato dell’UDCA C-6β-sostituito con una potente e selettiva attività su GPBAR1. In un modello murino di NASH, BAR501 è riuscito a revertire l’insulino-resistenza, l’aumento del peso del grasso epididimale (epWAT) e la funzionalità del grasso bruno (BAT) promuovendo il dispendio energetico e il browning dell’epWAT [8]. Inoltre, BAR501 si è dimostrato efficace in modelli murini nella cura delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBDs). I cisteinil leucotrieni (CysLTs) rappresentano una famiglia di potenti mediatori lipidici proinfiammatori prodotti a partire dall'acido arachidonico mediante l’azione della 5-lipossigenasi (5-Lox) e la proteina attivante la 5-lipossigenasi (FLAP) secreti dalle cellule immunitarie in risposta ad uno stimolo specifico. Essi sono prodotti principalmente da granulociti, macrofagi, mastociti, linfociti B ed eosinofili. Inoltre, anche altre cellule come fibroblasti bronchiali, piastrine, eritrociti, cellule epiteliali ed endoteliali possono produrre CysLTs. Queste molecole svolgono numerose attività biologiche e sono state identificate come responsabili di diversi processi patologici. In particolare sono coinvolte in reazioni asmatiche e allergiche e agiscono in modo tale da sostenere e amplificare localmente i processi infiammatori. Inoltre svolgono molteplici ruoli nelle epatopatie acute e croniche. Ad esempio, numerosi studi hanno messo in evidenza il ruolo dei CysLTs nella patogenesi dell’epatite fulminante. In uno studio, in particolare, è stato osservato che in ratti trattati con la combinazione di un’endotossina e d-galattosamina a dosi non letali, la sintesi dei CysLTs aumenta in risposta al trattamento e che l’antagonismo dei recettori dei CysLTs protegge dal danno epatico, mentre gli inibitori della cicloossigenasi non sortiscono alcun effetto benefico. E’noto, inoltre, che i CysLTs stimolano la proliferazione cellulare e la sintesi del collagene, suggerendo che l'aumento della produzione di CysLTs può contribuire al processo di fibrosi. I CysLTs, una volta sintetizzati, esercitano i loro effetti legandosi ai recettori dei cisteinil leucotrieni (CysLTRs), una famiglia di recettori accoppiati a proteine G transmembrana (G protein-coupled receptor, GPCR) della classe della rodopsina. Sono stati identificati due principali CysLTRs: CysLT1R e CysLT2R che riconoscono rispettivamente i loro ligandi nel seguente ordine di affinità LTD4 > LTC4 > LTE4 e LTC4 > LTD4 > LTE4. Il CysLT1R è espresso nella maggior parte dei tessuti umani, incluso il fegato e, in particolare, si ritrova su monociti, macrofagi residenti, eosinofili, basofili, mastociti, neutrofili, linfociti T e B, cellule dell’endotelio vascolare e cellule stellate epatiche (HSC).Il CysLT2R è espresso prevalentemente a livello cardiaco e neuronale. L’ importanza di questi recettori nel processo infiammatorio ha promosso, nel tempo, lo sviluppo di farmaci, cosiddetti antagonisti, che inibiscono la loro attività. Sebbene non siano noti antagonisti specifici per il CysLT2R, diversi farmaci come Montelukast (MTK, Singulair®), Zafirlukast (Accolate®) e Pranlukast (Onon®, Azlaire®), sono stati già sviluppati e messi in commercio per essere impiegati nella prevenzione e nel controllo degli attacchi di asma. Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato come il Montelukast sia in grado anche migliorare il danno epatico in modelli murini grazie alle sue attività antinfiammatoria ed antiossidante. Oltre a queste molecole ben caratterizzate, nel corso degli anni sono stati segnalati molti altri antagonisti dei CysLTRs e alcuni di essi sono stati ampiamente testati in ambito preclinico e clinico, senza tuttavia raggiungere gli obiettivi necessari al fine di proseguire nelle fasi di sperimentazione. L'ultimo gruppo comprende, tra gli altri, l'alfa-pentil-3-[2-chinolinilmetossi] alcol benzilico (REV5901). Attualmente, un’area sempre più in crescita nel processo di sviluppo dei farmaci è quella del drug reprofiling o riposizionamento dei farmaci. In effetti, il processo di identificazione di nuove applicazioni per molecole esistenti o accantonate è un approccio efficiente per massimizzare gli investimenti nella ricerca farmacologica in considerazione del fatto che queste molecole hanno già attraversato le numerose fasi di ricerca pre-clinica e clinica e quindi risultano già ben caratterizzate sotto il profilo di efficacia e sicurezza. Nel perseguire questo approccio, abbiamo scoperto che il REV5901, un antagonista del CysLT1R attivo per via orale, lega e attiva il recettore degli acidi biliari GPBAR1, con una EC50 di 2,5 µM, ospitando il sito di legame per il recettore come mostrato dall'analisi in silico ed esercitando un’attività antinfiammatoria GPBAR1-dipendente in modelli murini di infiammazione intestinale. In questo scenario il presente progetto di tesi si inserisce in un ampio programma multidisciplinare che combina metodi computazionali (screening virtuale e dinamica molecolare), sintesi chimica e valutazione farmacologica sperimentale in modelli in vitro ed in vivo, con l’obiettivo di identificare molecole con attività duale nei confronti dei recettori CysLTRs e GPBAR1, in particolare antagonisti del CysLT1R/agonisti di GPBAR1 e valutarne l’attività antinfiammatoria in modelli di epatite. Sebbene i due recettori condividano poche somiglianze dal punto di vista strutturale, attraverso simulazioni avanzate di binding molecolare, accompagnate da successivi saggi in vitro di attività della Luciferasi, siamo stati in grado di sviluppare un farmacoforo unico a partire dalla struttura chinolinica del REV5901 identificando nello stesso un potenziale scaffold chimico per lo sviluppo di nuovi ligandi non steroidei duali antagonisti del CysLT1R/agonisti di GPBAR1, da qui la prima famiglia di derivati del REV5901 denominati CHIN. Sulla base dei dati di efficacia e di EC50 su GPBAR1 e IC50 sul CysLT1R ottenuti, tra i composti della serie, il miglior candidato duale è risultato il CHIN117 con una EC50 di 4.6 µM e un IC50 di 5.7 µM. CHIN117, infatti, si è rivelato un potente duale antagonista del CysLT1R/agonista di GPBAR1, dotato di un eccellente profilo farmacodinamico e farmacocinetico. Il passo successivo all’identificazione e alla profilazione del nostro miglior candidato, è stato quello di valutare la sua efficacia in un modello murino di epatite cronica indotta da una dieta ricca di grassi che simula la steatoepatite non alcolica (NASH) in quanto è stato già ampiamente dimostrato in diversi modelli animali di NAFLD/NASH che questi due recettori sono coinvolti nello sviluppo della malattia. Tuttavia non ci sono ancora studi sulla potenziale attività sinergica dei due recettori su questo modello. Successivamente il CHIN117 è stato testato in un modello murino di epatite acuta indotta da paracetamolo mettendolo a confronto con il Montelukast, antagonista di riferimento del CysLT1R (IC50 2.3 nM) e il BAR501, agonista selettivo di GPBAR1 (EC50 1 µM) poiché l’efficacia dei due composti ad azione singola, BAR501 e Montelukast, in questo modello murino era stata già dimostrata. I risultati dei due studi presentati nel mio lavoro di tesi mostrano che il CHIN117 si è rivelato una promettente molecola in grado di ridurre la risposta proinfiammatoria sia in un modello di epatite cronica (NAFLD/NASH) che in un modello di danno epatico acuto indotto da farmaci (in particolare da acetaminofene, APAP), mettendo in evidenza l’importanza dell'approccio combinato nel ridurre l’infiammazione epatica.

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