Fiore, Alberto (2006) Biologic al role of Pseudomonas lipodepsipeptides. [Tesi di dottorato] (Inedito)

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Abstract

Il piano sperimentale ha previsto la crescita di alcuni ceppi di Pseudomonas produttori di differenti Lipodepsipeptidi (LDP). È stata valutata la produzione di nuovi lipodepsipeptidi, ne è stata caratterizzata la struttura mediante NMR e l’attività biologica. Due nuovi LDPs sono stati identificati: la Cormicina (CM) un lipodepsinonapeptide prodotto da Pseudomonas corrugata e SP508, una siringopeptina da 22 aminoacidi prodotta da P. syringae pv. lachrymans strain 508. Di entrambe ne è stata caratterizzata l’attività biologica contro batteri e funghi patogeni per l’uomo e per le piante. Le tossine di Pseudomonas prodotte sono state liofilizzate e utilizzate in saggi in vitro contro spore di funghi potenzialmente patogeni per le piante (mele) sia in campo che in post raccolta. Sono stati individuati alcuni patogeni e sistemi modello, di più facile preparazione e conservazione, che permettano una rapida e significativa valutazione dell’efficacia antimicrobica dei metaboliti purificati. I sistemi modello derivano essenzialmente dalla membrana plasmatica di patogeni importanti per alcune delle colture di interesse locale, come le mele. I funghi utilizzati sono Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Penicilim digitatum e Fusarium oxisporum. Inoltre si è proposto di chiarire il meccanismo d’azione dei lipodepsipeptidi, metaboliti secondari di Pseudomonas syringae e Pseudomonas. corrugata, mediante l’utilizzo di vari ceppi di Saccharomyces cerevisiae (S.C.) geneticamente modificati negli sfingolipidi e negli steroli di membrana. I saggi effettuati mostrano che i diversi LDP hanno un meccanismo di azione simile (Pore Forming Toxins) ma mostrano una differente interazione con la membrana, in particolare i metaboliti prodotti da P.corrugata a differenza di quelli prodotti da P.syringae sono maggiormente attivi su ceppi di SC senza steroli di membrana. Inoltre la CM e la CP sembrano non interagire con l’OH in posizione α sulla catena lipidica dello sfingolipide, mentre lo stesso OH risulta indispensabile per l’attività della SRE e SP22, anche l’OH legato al C-4 risulta indispensabile per l’attività di SRE, CM e SP22. Solo la SP22 è attiva anche quando è assente l’inositolo sull’antenna glicidica dello sfingolipide (con la carica negativa portata dal fosfato). Sono stati altresì effettuati esperimenti di biocontrollo su mele utilizzando diversi ceppi di Pseudomonas spp. Evidenziando che alcuni ceppi, pur non produttori di LDP, hanno avuto effetti antagonistici superiori ai ceppi produttori di LDPs nei confronti di alcuni funghi patogeni delle mele. Si presuppone pertanto che l’attività antifungina di questi batteri sia dovuta alla loro maggiore produzione di enzimi chitinolitici. È stata pertanto analizzata la capacità di produrre enzimi da parte dei ceppi di Pseudomonas testati, è stata testata la produzione di endo ed eso chitinosi. I saggi di biocontrollo mostrano che isolati di P.syringae 1480A e 46P riducono i sintomi nella post-raccolta quando una sospensione batterica e conidi di patogeno sono stati inoculati a diverse concentrazioni. Questi batteri hanno anche un eccellente risultato nel limitare la formazione di marciumi immergendo le mele nella sospensione batterica. Sono state avanzate delle preoccupazioni nella commercializzazione di preparati a base di Pseudomonas a causa dell’attività emolitica dei suoi metaboliti a concentrazioni superiori a 1 μM, ma non sono ancora noti dati sulla possibile interazione uomo-lipodepsipeptidi. Inoltre, non è ancora del tutto chiaro se questi metaboliti possano essere assorbiti dalle cellule dell’uomo o essere degradati dagli enzimi proteolitici dell’apparato digerente. D'altronde la letalità per gli eritrociti, test normalmente impiegato per valutare la patogenicità per l’uomo, non implica necessariamente che un composto non possa essere usato come antibiotico: l’attività emolitica si può presentare infatti a concentrazioni molto maggiori di quelle necessarie per avere un’attività contro i patogeni fungali. In quest’ottica sono stati effettuati saggi in vitro simulando una digestione umana di LDP (SRE). L’esperimento è stato condotto mediante l’utilizzo in varie concentrazioni di enzimi del tratto gastroenterico coinvolti nella digestione proteica: pepsina per lo stomaco, tripsina e α chimotripsina per il tratto intestinale e pronase. Si è notato un sensibile decremento dell’ attività emolitica della tossina nelle diverse fasi della digestione, specialmente durante la fase intestinale ad opera di tripsina e α chimotripsina, contemporaneamente ad un decremento della concentrazione di SRE calcolata mediante HPLC.

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