Turrà, David (2006) Espressione di inibitori di proteasi di origine vegetale potenzialmente utili al controllo di agenti fitopatogeni. [Tesi di dottorato] (Inedito)

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Abstract

Agenti patogeni, sia di natura biotica che abiotica, stimolano nelle piante la sintesi delle proteine PR, tra cui gli inibitori di proteasi (PI). Gli inibitori di proteasi di natura proteica, solitamente classificati come PR-6, hanno massa molecolare variabile tra i 6 ed gli 80 kDa, sono ubiquitari in natura e raggruppati in base alla classe di proteasi (serina, cisteina, metallo o aspartico proteasi) che sono in grado di inibire. Nelle piante i PI svolgono diverse funzioni fisiologiche come quelle di proteine di riserva, di regolazione dell’attività proteasica endogena, di modulazione dei processi apoptotici, di stabilizzazione delle proteine e di difesa attive nei confronti di animali, insetti e microrganismi. I PI sono in grado di influenzare la sintesi della chitina nei funghi, di ridurre la crescita di insetti e nematodi, e di inibire l’attività proteasica espressa da diversi microbi. Sebbene l’effetto insetticida e nematocida dei PI sia ben noto, non è ancora chiaro se la loro sovraespressione in pianta possa incrementare la resistenza contro patogeni fungini. Avendo determinato durante un precedente lavoro le sequenze amminoacidiche parziali di diversi PI, purificati da germogli di patata e potenzialmente attivi contro diversi agenti fitopatogeni, abbiamo amplificato (tramite PCR e RACE 5’) e clonato i geni PKI1 e PKI2 appartenenti alla famiglia degli inibitori Kunitz ed i cDNA dei geni PPI3B2, PPI3A2, PPI3A4, PPI2C4 e PPI2C1A appartenenti alla famiglia dei proteinase inhibitor 1 (PI1). Tra questi abbiamo considerato con particolare interesse l’inibitore Kunitz PKI1 e il PI1 PPI3B2, perché dotati di attività antimicrobica ed inibitoria in generale. Analisi Southern effettuata sul DNA genomico di Solanum tuberosum cv. Desireè ha confermato la presenza dei due geni nel genoma di patata e la presenza di almeno nove geni appartenenti alla famiglia dei PI1. L’analisi del profilo di espressione dei tre gruppi di omologia (A, B, C), costituenti la famiglia genica Kunitz, e di tre membri (PPI3B2, PPI3A2, PPI2C4) della famiglia PI1 ha dimostrato che entrambe le famiglie sono espresse a seguito dell’infezione con il nematode Globodera rostochiensis e che l’intensità, lo spettro di inibitori prodotti e la velocità di induzione sono in patata strettamente genotipodipendente. Evidenze del coinvolgimento del “pathway” dell’JA, ma non dell’SA, nell’interazione patata-G. rostochiensis sono invece state ottenute studiando l’espressione di geni delle famiglie Pin2 e PR1. Il gene PKI1 è stato, infine, introdotto nel ceppo di espressione BL21(DE3)PLYsS di Escherichia coli per poter purificare quantità sufficienti a saggiare in vivo l’attività biologica del relativo prodotto proteico. L’analisi del profilo proteico effettuata mediante SDSPAGE ha evidenziato la presenza di una banda differenzialmente espressa solo nell’estratto ottenuto dalla frazione insolubile della coltura indotta. La proteina chimerica (23 kDa) è stata purificata dai corpi di inclusione sia in condizioni denaturanti che non denaturanti.

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