Longo, Mariangela (2008) Meccanismi biochimici coinvolti nell’apoptosi CpHV-1-indotta. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Item Type: Tesi di dottorato
Resource language: Italiano
Title: Meccanismi biochimici coinvolti nell’apoptosi CpHV-1-indotta
Creators:
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Longo, Mariangela
mari-lm@libero.it
Date: 25 November 2008
Number of Pages: 112
Institution: Università degli Studi di Napoli Federico II
Department: Strutture, funzioni e tecnologie biologiche
Dottorato: Biologia, patologia e igiene ambientale in medicina veterinaria
Ciclo di dottorato: 21
Coordinatore del Corso di dottorato:
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Paino, Giuseppe
UNSPECIFIED
Tutor:
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Pagnini, Ugo
upagnini@unina.it
Date: 25 November 2008
Number of Pages: 112
Keywords: CpHV-1, apoptosi, pathway biochimici
Settori scientifico-disciplinari del MIUR: Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > VET/05 - Malattie infettive degli animali domestici
Date Deposited: 06 Nov 2009 12:13
Last Modified: 27 Nov 2014 11:13
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/3091
DOI: 10.6092/UNINA/FEDOA/3091

Collection description

L’apoptosi è un processo fisiologico presente in tutti gli eucarioti multicellulari che si verifica durante le prime fasi dello sviluppo. Morfologicamente, l’apoptosi risulta caratterizzata da vacuolizzazione del citoplasma, condensazione della cromatina e formazione di corpi apoptotici, mentre da un punto di vista biochimico si distingue per l’attivazione di proteasi specifiche (caspasi) e per la degradazione del DNA in frammenti oligonucleosomiali. Gli eventi apoptotici possono essere indotti da molteplici stimoli intra-cellulari (danni al DNA, gravi stress al reticolo endoplasmatico o ai mitocondri) e/o extra-cellulari (azione di ormoni e di fattori di crescita; infezioni virali). In particolare, nell’apoptosi virus-indotta, gli Herpesvirus sembrano esercitare un fine controllo della risposta apoptotica cellulare, attraverso il coinvolgimento di meccanismi ancora non completamente conosciuti. Caprine Herpesvirus 1 (CpHV-1) è responsabile di infezioni sistemiche che colpiscono i capretti nelle prime due settimane di vita, con febbre, scolo nasale, diarrea. Ma il virus è stato isolato anche da capre con vulvovaginite, turbe respiratorie e lesioni proliferative a carico di labbra e palato duro. Inoltre, è in grado di esplicare attività abortigena e, al pari di altri Herpesvirus, dà luogo ad infezioni latenti suscettibili di riattivazione. E’ noto che CpHV-1 sia in grado d’indurre apoptosi in cellule mononucleate di sangue (Pagnini et al., 2005), al pari di BoHV-1 (Hanon et al., 1997, 1998; Winkler et al., 1999; Delhon et al., 2002), antigenicamente e geneticamente correlato ad esso. Dal momento che BoHV-1 induce apoptosi anche in cellule di origine epiteliale (Devireddy & Jones, 1999; Geiser et al., 2008), abbiamo studiato la capacità di CpHV-1 di indurre apoptosi, utilizzando come modello sperimentale la linea cellulare Madin Darby bovine kidney (MDBK), oggetto di questa tesi. Inoltre, sono state messe in luce alcune caratteristiche del processo apoptotico che si verifica in questo substrato. Pertanto, la descrizione della capacità di CpHV-1 di interagire con i meccanismi che presiedono alla morte cellulare programmata potrebbe aprire nuove prospettive nella comprensione dei meccanismi che sottintendono la patogenesi dell’ infezione causata da questo virus. La scelta dell’argomento è correlata alla necessità di comprendere i meccanismi patogenetici che portano alle manifestazioni cliniche da CpHV-1, diffuso in diversi Paesi del Mediterraneo e, in particolare, in alcune regioni del sud Italia, dove provoca gravi perdite economiche, sia per i disordini riproduttivi di cui è direttamente responsabile, sia per le infezioni secondarie conseguenti allo stato di immunosoppressione degli animali. In seguito all’infezione delle cellule MDBK con CpHV-1, a differenti molteplicità d’infezione (m.o.i.) (0.1, 1 e 10), si è riscontrata una riduzione della vitalità cellulare in maniera dose-tempo dipendente, utilizzando un saggio colorimetrico che misura l’attività metabolica cellulare (MTT test). Inoltre, è stata evidenziata l’associazione tra la diminuzione di vitalità cellulare e la produzione di nuova progenie virale. A partire da 12 ore post infezione (p.i.), la morfologia cellulare è apparsa drasticamente cambiata: le cellule, arrotondate, si staccavano dal monostrato infettato e, impiegando la colorazione con arancio d’acridina, è stato possibile visualizzare la frammentazione nucleare. Il ladder internucleosomiale tipico dell’apoptosi è stato rilevato già a 24 ore p.i. Il fenomeno apoptotico è stato, poi, quantificato mediante colorazione del DNA delle cellule infette con propidio ioduro, metodica che mette in evidenza il picco ipodiploide corrispondente alle cellule apoptotiche e ai corpi apoptotici. Il picco si apprezzava già a 8 ore p.i. nelle cellule infettate alle m.o.i più alte (1 e 10), e a 24 ore p.i. a m.o.i 0.1. Tra i meccanismi coinvolti nell’apoptosi, attraverso analisi western blotting e citofluorimetria a flusso, è stato dimostrato che l’apoptosi indotta da CpHV-1 è associata all’attivazione sia di caspasi iniziatrici, quali caspasi-8 e caspasi-9, sia di caspasi effettrici, come caspasi-3. È stato evidenziato, inoltre, il clivaggio di PARP, enzima di riparo del DNA, necessario alla sopravvivenza cellulare, a partire da 8 ore p.i. Lo studio dell’effetto degli inibitori specifici delle caspasi sull’infezione da CpHV-1, è stata riscontrata la liberazione di nuova progenie virale. I segnali che conducono alla morte cellulare programmata possono provenire sia dalle interazioni di ligandi extracellulari a recettori specifici esposti sulla membrana plasmatica, che da eventi apoptotici mitocondriali. Alcuni effetti che si riflettono sulla funzionalità mitocondriale riguardano il calo della differenza del potenziale transmembranario (m) e la liberazione del citocromo C eventi che in questo lavoro sono stati apprezzati già a 8 ore dall’infezione. La modulazione tra segnali di morte e di sopravvivenza che coinvolgono la cellula durante l’apoptosi è effettuata da diverse proteine, come la famiglia Bcl-2 che comprende sia membri pro-apoptotici (come Bax o Bid), che anti-apoptotici (Bcl-XL e Bcl-2). Nelle cellule infettate con CpHV-1, è stato dimostrato che sia l’mRNA di Bax che la proteina erano presenti a partire da 8 a 24 ore p.i., quando appunto Bid risultava attivato. Rispetto al controllo, i livelli di mRNA dei membri antiapoptotici studiati rimanevano invariati nel corso dell’infezione, mentre l’espressione delle proteine relative era inferiore già a partire da 8 ore p.i. Questi risultati dimostrano che non c’è alcuna interferenza da parte del virus nella trascrizione dei geni della famiglia Bcl-2. Quindi la regolazione dell’espressione di Bcl-2 dipende dalle caspasi, attive già a 8 ore p.i. I dati riportati in questo lavoro dimostrano chiaramente che CpHV-1 è in grado di indurre apoptosi in cellule MDBK, così come accade in altri substrati quali le PBMC (Pagnini et al., 2005). Inoltre, in confronto all’apoptosi BoHV-1-indotta in cellule MDBK, dove gli eventi apoptoci sono stati descritti nelle utime ore dell’infezione (Devireddy & Jones, 1999; Geiser et al., 2008), CpHV-1 provoca precocemente apoptosi nelle MDBK, anche se cellule di origine epiteliale, che generalmente risultano più resistenti alla morte cellulare programmata (Wesselborg et al., 1993). L’apoptosi delle cellule infettate causa la distruzione dei tessuti e delle cellule stesse, così come le risposte infiammatorie. Di conseguenza, nelle infezioni associate al CapHV-1, l’apoptosi delle cellule costituenti i tessuti dell’apparato respiratorio e genitale potrebbe essere responsabile delle manifestazioni patologiche determinate dal virus.

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