Pecchia, Paola (2008) Interventi di ingegneria genetica per aumentare la produzione di metaboliti vegetali con attività biocida. [Tesi di dottorato] (Inedito)

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Abstract

Nelle piante sono presenti numerosi metaboliti con attività biocida tra cui le saponine triterpenoidiche, implicate nei meccanismi di difesa della pianta. La loro attività biologica, principalmente legata all’interazione con le membrane cellulari, si manifesta inibendo la crescita di funghi, batteri, insetti e nematodi. Tre nuove saponine triterpenoidiche, Astersedifolioside A, B, C, identificate nella specie Aster sedifolius, mostrano un’inibizione della crescita di funghi fitopatogeni tellurici e del batterio Xanthomonas campestris. Le saponine sono costituite da una porzione glicosidica e da una agliconica detta sapogenina. Il primo step nella sintesi dell’aglicone avviene ad opera degli enzimi 2,3-ossidosqualene ciclasi (OSC) che ciclizzano il 2,3 ossidosqualene. Presso il gruppo di ricerca del CNR-IGV di Portici, dove si è svolta la tesi di dottorato, in A. sedifolius era stato isolato il gene AsOXA1 (GenBank AY836006) codificante l’OSC coinvolta presumibilmente nella biosintesi della β-amirina, che costituisce l’aglicone degli Astersedifoliosidi. Poiché il fattore limitante per l’uso delle biomolecole su larga scala è rappresentato dalla ridotta produzione in planta l’obiettivo principale della tesi di dottorato è stato quello di definire una strategia genetica idonea a migliorare la produzione di tali sostanze utilizzando il gene AsOXA1. Inoltre, il progetto della presente tesi di dottorato si è proposto di verificare la possibilità di impiegare le saponine triterpenoidiche estratte dall’Aster come biopesticidi. Nell’ambito di quest’ultimo obiettivo sono stati eseguiti saggi di attività biologica con le farine di foglia e radice di A. sedifolius e A. caucasicus nei confronti di insetti, in collaborazione con il Dott. De Cristofaro (Dipartimento di Scienze Animali, Vegetali e dell’Ambiente, Università del Molise), e nei confronti di nematodi, in collaborazione con il Dott. Di Vito (CNR-IPP, Bari). I risultati hanno indicato una significativa riduzione nello sviluppo del Tenebrio molitor e nella riproduzione del nematode galligeno Melodoidogyne javanica. Sono state, inoltre, effettuate in collaborazione con la Dott.ssa Borrelli (Dipartimento di Farmacologia Sperimentale, Università di Napoli Federico II) valutazioni tossicologiche su topi in vivo ed in vitro per esaminare la tossicità acuta e cronica degli estratti dalle parti aeree di A. sedifolius, della miscela di saponine e dell’Astersedifolioside C che sono risultati innocui anche a dosi elevate. Per quanto riguarda l’intervento di ingegneria genetico-metabolico eseguito in questo progetto di dottorato, come primo risultato è stata dimostrata mediante la trasformazione del lievito Saccharomyces cerevisiae la funzione di AsOXA1 come β-amirina sintasi. E’ stato costruito un vettore di espressione con il cDNA full-length di AsOXA1 sotto il controllo del promotore CaMV35S e tale costrutto è stato inserito in diversi ceppi di Agrobacterium tumefaciens (EHA105 e GV3101). Tali ceppi sono stati usati per la trasformazione delle specie Aster caucasicus (specie affine all’A. sedifolius), Medicago truncatula e Arabidopsis thaliana. Quest’ultime sono specie modello che producono rispettivamente saponine triterpenoidiche e triterpeni. In A. caucasicus è stato messo a punto il metodo di trasformazione e sono stati prodotti da espianti fogliari calli transgenici che esprimono AsOXA1. Sono state effettuate diverse subculture dei calli transgenici per ottenere quantità sufficienti ad eseguire le analisi biochimiche, svolte in collaborazione con la Prof. De Tommasi, Università di Salerno, dove la dottoranda ha trascorso alcuni mesi. Le parti aeree di A. caucasicus producono derivati dell’acido quinico e sorprendentemente mostrano l’assenza di saponine triterpenoidiche tipiche del genere Aster. Il callo trasformato di A. caucasicus ha evidenziato mediante analisi LC/MS dell’estratto solubile in butanolo la presenza di composti triterpenici tipici di A. sedifolius, oltre che una maggiore quantità di composti derivati dall’acido quinico. La trasformazione genetica di M. truncatula è stata effettuata in collaborazione con il Dott. Confalonieri (CRA, Istituto Sperimentale delle Colture Foraggere di Lodi). Analisi a livello genomico hanno evidenziato la trasformazione di sei linee che, analizzate tramite Real Time, hanno mostrato diversi livelli di espressione di AsOXA1. Le stesse linee transgeniche, sottoposte all’analisi biochimica delle principali sapogenine prodotte in foglia e radice, hanno evidenziato che il contenuto totale delle sapogenine aumenta rispetto al controllo non trasformato. In particolare risultano incrementate le concentrazioni dell’acido medicagenico, dell’acido zanico e di quello bayogenico. La trasformazione di A. thaliana è stata realizzata presso il Dept. of Horticulture and Landscape Architecture della Purdue University (U.S.A.) ed ha consentito di selezionare dieci piante transgeniche T1 per AsOXA1. E’ stata ottenuta una linea omozigote per il transgene sulla quale sono in corso le analisi biochimiche. La specie modello A. thaliana è un eccellente sistema genetico che consentirà tramite le analisi combinate del genoma, del trascrittoma e del metaboloma, di valutare gli effetti che la sovraespressione di AsOXA1 causa sul pathway biosintetico dei triterpeni ed, eventualmente, su altri pathway. I risultati conseguiti con la presente tesi di dottorato indicano che esiste la possibilità di individuare in Aster molecole con attività biocida da utilizzare in ambito agrochimico. Inoltre è possibile tramite ingegneria genetica intervenire nel pathway di sintesi delle saponine triterpenoidiche agendo sull’enzima OSC (AsOXA1) che catalizza la produzione della porzione agliconica triterpenica. Infine, occorre sottolineare come la realizzazione di questo progetto sia stata possibile grazie alla sinergia tra ricercatori con diverse competenze

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