Luisi, Rosa (2008) Ruolo dei canali del K+ presinaptici nella regolazione delle concentrazioni intracellulari di Ca2+ durante la liberazione di neurotrasmettitori da terminazioni nervose isolate Ruolo dei canali del K+ presinaptici nella regolazione delle concentrazioni intracellulari di Ca2+ durante la liberazione di neurotrasmettitori da terminazioni nervose isolate. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Item Type: Tesi di dottorato
Language: Italiano
Title: Ruolo dei canali del K+ presinaptici nella regolazione delle concentrazioni intracellulari di Ca2+ durante la liberazione di neurotrasmettitori da terminazioni nervose isolate Ruolo dei canali del K+ presinaptici nella regolazione delle concentrazioni intracellulari di Ca2+ durante la liberazione di neurotrasmettitori da terminazioni nervose isolate
Creators:
CreatorsEmail
Luisi, Rosarosa.luisi@unina.it
Date: 27 November 2008
Number of Pages: 135
Institution: Università degli Studi di Napoli Federico II
Department: Neuroscienze. Sezione di Farmacologia
Doctoral School: Medicina molecolare
PHD name: Neuroscienze
PHD cycle: 21
PHD Coordinator:
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Annunziato, Luciolannunzi@unina.it
Tutor:
nameemail
Taglialatela, Mauriziomtaglial@unina.it
Date: 27 November 2008
Number of Pages: 135
Uncontrolled Keywords: Neurotrasmissione, glutammato,canali del potassio presinaptici
MIUR S.S.D.: Area 05 - Scienze biologiche > BIO/14 - Farmacologia
Date Deposited: 10 Nov 2009 14:08
Last Modified: 30 Apr 2014 19:35
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/3205

Abstract

RUOLO DEI CANALI DEL K+ PRESINAPTICI NELLA REGOLAZIONE DELLE CONCENTRAZIONI INTRACELLULARI DI Ca2+ DURANTE LA LIBERAZIONE DI GLUTAMMATO DA TERMINAZIONI CORTICALI ISOLATE Il rilascio di neurotrasmettitori è un processo complesso che richiede l’attività altamente coordinata di numerose proteine sinaptiche e differenti canali ionici localizzati a livello del terminale presinaptico. Particolare attenzione è stata rivolta negli ultimi anni al ruolo presinaptico di una nota corrente neuronale, selettiva per gli ioni K+, denominata M (IKM), in quanto soppressa dall’attivazione di recettori muscarinici e sottesa dall’assemblaggio eterotetramerico di subunità di canali del potassio denominate Kv7 (KCNQ) in particolare Kv7.2 e Kv7.3 Lo scopo del presente studio è stato quello di valutare il possibile coinvolgimento di IKM nel rilascio di aspartato (D-Asp) indotto da molteplici stimoli da terminali corticali ed, in particolare, investigare i meccanismi biochimici che sottendono tale modulazione. Per tale scopo abbiamo combinato esperimenti di microscopia confocale, voltage e calcium-imaging con esperimenti di release di [3H]D-Asp servendoci di preparazioni sinaptosomiali crude e purificate su gradiente di percoll, un’alternativa ideale per isolare in vitro la sinapsi. Esperimenti morfologici e biochimici evidenziano un’ampia distribuzione della subunità Kv7.2 a livello presinaptico sia nel tessuto corticale che su sinaptosomi glutammatergici isolati. La retigabina (RT, 10 µM), un attivatore selettivo della IKM, inibisce il rilascio corticale di [3H]D-Asp evocato da 20 mM [K+]e, un effetto completamente prevenuto dall’XE-991 (20µM), un bloccante della IKM. Ugualmente, la RT (0.1-30µM ) produce in maniera dose-dipendente e reversibile una significativa riduzione degli incrementi delle concentrazioni intracellulari di Ca2+ ([Ca2+]i) indotti da depolarizzazione con un Emax=38±7% e un IC50=0.89±0.16 μM; al contrario, l’XE-991 (20µM) aboliscecompletamente tale effetto. Inoltre, l’effetto inibitorio della RT sulle variazioni delle [Ca2+]i e sul rilascio di [3H]D-Asp indotto da depolarizzazione viene prevenuto dall’utilizzo di anticorpi policlonali diretti contro la subunità Kv7.2 confermando lo specifico coinvolgimento dei canali Kv7.2 nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+ a livello presinaptico e di conseguenza nel controllo del rilascio di glutammato da sinaptosomi cerebrocorticali. In aggiunta, l’Agatoxin IVA (150 nM), un bloccante selettivo dei canali del calcio voltaggio-dipendenti (VOCCs) di tipo P/Q sembrava reverte completamente l’effetto inibitorio della RT sulle variazioni delle [Ca2+]i e sul rilascio di [3H]D-Asp evocato da 20 mM [K+]e. Tuttavia la RT non modifica i livelli del Ca2+ intracellulare e il risultante rilascio di aspartato indotto da mobilizzazioni intracellulari di Ca2+ come quelle derivanti dalla deplezione degli stores intracellulari o dall’ingresso di Ca2+ mediante attivazione dei canali del Ca2+ di membrana sensibili alla deplezione degli stores intracellulari (SOCCs). In conclusione, IKM sembra svolgere un importante ruolo presinaptico sul rilascio di D-Aspartato corticale mediante il controllo selettivo dei flussi di Ca2+ mediati dai VOCCs di tipo P/Q e non da mobilizzazioni di Ca2+ voltaggio-indipendenti. Inoltre, questi risultati contribuiscono a chiarire il profilo farmacologico di potenziali farmaci anticonvulsivanti agenti sulla corrente M. Nel sistema nervoso centrale i canali KCNQ non sono l’unica classe di canali del K+ presente sul terminale nervoso, ma, anche altri canali del K+ sembrano giocare un ruolo strategico a livello presinaptico. Diversi studi morfologici,hanno evidenziato un’ampia espressione dei canali BKCa a livello presinaptico, in particolare in corteccia ed ippocampo. Studi funzionali hanno dimostrato il coinvolgimento di tali canali, specificamente espressi nelle zone attive delle sinapsi, nella regolazione del rilascio di NT in diversi distretti. Pertanto, obbiettivo della seconda parte del lavoro è stato valutare il possibile coinvolgimento anche dei canali BKCa nella regolazione selettiva del rilascio di D-Aspartato triziato da terminali nervosi corticali ed, in particolare, investigare i meccanismi alla base di tale modulazione. I nostri dati dimostrano che i canali BKca presenti sui terminali glutammatergici possono regolare il rilascio di glutammato non in maniera generale ma in maniera altamente selettiva. Infatti, la IbTx (30nM), un peptide che blocca in maniera selettiva i canali BKca, stimola, in maniera reversibile e dose dipendente, il rilascio di [3H]D-Asp indotto dall’esposizione al 15 mM [K+]e solo dai sinaptosomi isolati dalla corteccia e dall’ippocampo ma non da cervelletto dove il canale sembra scarsamente espresso. Al contrario, la IbTx non influenza il rilascio di [3H]NE e[3H]GABA da sinaptosomi corticali. In corteccia (come nell’ippocampo) i canali BKca controllano l’eccitabilità sinaptica. L’apertura dei canali BKca tende ad iperpolarizzare la sinapsi guidandola verso il potenziale di equilibrio del K+, la IbTx bloccando il canale depolarizza il terminale aumentando i flussi di Ca2+ attraverso i canali del Ca2+ voltaggio dipendenti prossimali presenti sul terminale sinaptico da cui deriva un aumento del rilascio di glutammato. I canali BKca appaiono essere selettivamente attivati dai flussi di Ca2+ mediati dai diversi sottotipi di VOCCs mentre, come si evince dai nostri esperimenti, sembrano essere insensibili all’aumento di Ca2+ ottenuto dallo svuotamento dei depositi intracelllulari e per questo da meccanismi Ca2+-indipendenti. In conclusione, i canali BKca modulano selettivamente il rilascio di glutammato controllando l’eccitabilità del terminale, dunque, l’attivazione di tali canali potrebbe essere utili per proteggere i neuroni dall’eccitotossicità da glutammato.

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