Moscato, Marco (2009) STUDI SUL RUOLO DELL'INIBITORE CITOSOLICO DI RIBONUCLEASI. [Tesi di dottorato] (Inedito)

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Abstract

L’Inibitore citosolico di Ribonucleasi (cRI) è una proteina ubiquitaria, evolutivamente conservata, di circa 50 kDa; una peculiare caratteristica di questa proteina è l’alto contenuto di cisteine. cRI è un potente scavenger di ROS in vitro; l’ossidazione dei tioli provoca la formazione di ponti disolfurici intra-molecolari con un meccanismo del tipo tutto-o-nulla, innescato dall’ossidazione di residui cisteinici adiacenti altamente reattivi. È stato dimostrato che lo stress ossidativo determina (la formazione) di una forma ossidata di cRI in cellule intatte; d’altronde la deplezione di cRI aumenta la sensibilità della cellula allo stress ossidativo. Queste prove suggeriscono fortemente un ruolo per cRI nell’omeostasi redox cellulare. Ho eseguito esperimenti di coimmunoprecipitazione alla ricerca di proteine interagenti con cRI. A tal scopo, una forma ricombinate di cRI con il tag 3xFlag è stata espressa in cellule HeLa. Flag-cRI e le proteine interagenti sono state immunoprecipitate e l’eluizione è stata eseguita con il tampone di caricamento Laemmli o per competizione con il peptide 3xFlag. Gli immunocomplessi sono stati analizzati mediante SDS-PAGE, western blotting e spettrometria di massa. I risultati mostrano che, nelle condizioni usate per gli esperimenti di coimmunoprecipitazione anti-Flag, diverse proteine legano cRI: in particolare una banda di 40 kDA corrispondente all’ actina è stata identificata. La coimmunoprecipitazione inversa anti-actina ha confermato l’interazione Flag-cRI-actina. Altre proteine come la catena pesante della miosina non muscolare II-a, la tubulina, la GAPDH, la glicoproteina di membrana di 210 kDa dei pori nucleari, la proteina dello shock termico di 71 kDa, la sintasi degli acidi grassi, EF-Tu, sono state identificate in immunocomplessi mediante spettrometria di massa. Analisi citologiche di immunofluorescenza indicano che cRI, actina e tubulina colocalizzano parzialmente. Inoltre, analisi pull-down hanno dimostrato che l’interazione del Flag-cRI con actina purificata è inibita da reagenti tiolici. Questi risultati suggeriscono che cRI, come scavenger di ROS, potrebbe proteggere il citoscheletro da stress ossidativi. Comunque nelle mie condizioni sperimentali, cRI non forma ponti disolfurici con altre molecole in cellule HeLa, né in condizioni basali né dopo un trattamento con agenti ossidanti. Dall’esame degli estratti nucleari e citoplasmatici di cellule HeLa, come anche dalle analisi di immunofluorescenza, è emerso che cRI non è esclusivamente localizzato nel citosol, ma è presente anche nel nucleo.

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