Iannotti, Fabio Arturo (2009) VALUTAZIONE DELL‟ESPRESSIONE E DEL RUOLO FUNZIONALE DEI CANALI IONICI VOLTAGGIO DIPENDENTI DEL POTASSIO Kv7 IN CELLULE MUSCOLARI SCHELETRICHE ATTRAVERSO STUDI MORFOLOGICI E BIOCHIMICI. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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L’interesse scientifico alla base dell’attività di ricerca svolta durante questi tre anni di dottorato si è indirizzato verso l’ identificazione e la caratterizzazione dei profili d’espressione genica per alcuni dei principali canali ionici voltaggio-dipendenti espressi durante il processo di differenziamento muscolare. Perseguendo tale obiettivo, si è cercato di correlare l’espressione dei principali canali ionici voltaggio-dipendenti investigati ed identificati, sia ad aspetti squisitamente funzionali (come le variazioni del potenziale di membrana, la proliferazione, il differenziamento, la vitalità cellulare, le variazioni di [Ca2+]i ecc.); sia ad eventuali condizioni fisiopatologiche come, ad esempio, in corso di danno muscolare dove alcuni dei principali canali ionici risultano essere coinvolti. Tra i canali ionici maggiormente investigati nel muscolo scheletrico in questo lavoro (ossia, Cav; Nav e Kv) il nostro interesse è stato rivolto principalmente alla sottofamiglia dei canali del potassio Kv7. Questa scelta è stata dettata in primo luogo, dall’intenzione di perseguire la tradizione scientifico-culturale del gruppo di ricerca guidato dal Prof. Maurizio Taglialatela dove per molti anni ed ancora tutt’oggi si studia sia il ruolo pre-sinaptico delle subunità Kv7.2-Kv7.3 nel controllo del rilascio di neurotrasmettitori sia eccitatori (aspartato e glutammato) che inibitori (Gaba) evocate da alte [K+]e; sia le conseguenze funzionali di alcune delle principali mutazioni presenti in queste stesse subunità Kv7.2-Kv7.3 che alterano così le capacità di conduttanza del canale stesso al proprio ione K+, con conseguente perdita della funzione di controllo sull’eccitabilità neuronale. Susseguentemente, la scelta di studiare i canali Kv7 nel muscolo scheletrico è stata dettata dalla constatazione che non ci sono studi presenti in letteratura scientifica dove si siano investigati i profili d’espressione e la funzionalità delle subunità Kv7 nel muscolo scheletrico, fatta la sola eccezione per Kv7.1 e Kv7.5. A tale scopo, come modello sperimentale, sono state utilizzate cellule di mioblasti murini (C2C12), che in specifiche condizioni sono in grado di differenziare terminalmente in cellule muscolari mature (miotubi). Le cellule C2C12, date queste caratteristiche, sono pertanto un modello di differenziamento miogenico in vitro ampiamente riconosciuto. Per la caratterizzazione del profilo d’espressione genica per le subunità Kv7 e per gli altri canali ionici, durante il processo di differenziamento miogenico, sono state utilizzate tecniche di estrazione e retrotrascrizione del RNA, isolato da cellule C2C12 sia nello stato indifferenziato (mioblasti) che di differenziamento (miotubi). Tecniche di microscopia confocale e western blot hanno consentito di confermare l’espressione proteica per le subunità Kv7.2-4 e studiare la corrispondente localizzazione tissutale in sezioni di muscolo isolato sia da topo e da uomo adulto. Attraverso l’ utilizzo di sostanze squisitamente ad azione agonista (Retigabina e Flupirtina, 10M) ed antagonista (XE991, 10M) come strumenti farmacologici validi , si è riusciti ad investigare e confermare il coinvolgemento dei canali Kv7 in diverse funzioni fisiologiche cellulari come la proliferazione ed il differenziamento in cellule muscolari C2C12. In riferimento ad aspetti anche d’ interesse fisiopatologico, sfruttando gli effetti miotossici (concentrazione-dipendente) dati dal trattamento nei mioblasti proliferanti con statina (Mevastatina 1-100M), si è riusciti a descrivere l’azione preventiva che gioca l’attivazione dei canali Kv7 in corso di danno muscolare.

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