Iorio, Mariangela (2009) Sviluppo di un nuovo metodo di screening genetico, per la ricerca di mutazioni nei geni BRCA1 e BRCA2 associati al carcinoma della mammella. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Abstract

I carcinomi della mammella e dell’ovaio rappresentano le prime cause di mortalità per tumore nel sesso femminile in tutto il mondo; in Italia ed in Europa sono diagnosticati ogni anno, rispettivamente, circa 38.000 e 430.000 nuovi casi di tumore della mammella. Il 90-95% di tutti i casi di carcinoma della mammella e dell’ovaio è da considerarsi di natura sporadica, il restante 5-10% è costituito da forme ereditarie a trasmissione autosomica dominante definite Hereditary Breast and Ovarian Cancer, HBOC. I geni che conferiscono il più elevato rischio di sviluppare questa sindrome tumorale ereditaria sono BRCA1 e BRCA2, identificati nei primi anni ’90. I soggetti che presentano la forma HBOC si distinguono da quelli con il carcinoma di tipo sporadico, soprattutto per la giovane età di insorgenza della malattia e la presenza in famiglia di numerosi casi di carcinoma, non solo della mammella, ma anche dell’ovaio e/o di altri organi. Inoltre, per quanto riguarda il carcinoma della mammella, è possibile riscontrarlo, seppure raramente, anche in soggetti di sesso maschile. Nelle famiglie con mutazioni a carico di tali geni, il rischio cumulativo di sviluppare il carcinoma mammario e/o ovarico entro i 70 anni di età, è pari rispettivamente all’80% ed al 40-60%. BRCA1 è un gene situato sul cromosoma 17, è composto da 24 esoni distribuiti su una regione genica di circa 100 kb e codifica una proteina di 1863 amminoacidi. BRCA2 si trova sul cromosoma 13, è costituito da 27 esoni che coprono una regione genica di circa 70 kb e produce una proteina di 3418 amminoacidi. Ad oggi, sono riportate più di 3000 differenti varianti di sequenza di BRCA1 e BRCA2 (patogeniche e non) distribuite uniformemente su tutta la lunghezza di entrambi i geni (BIC database). In particolare, le mutazioni più frequentemente associate ad aumentato rischio di sviluppare carcinoma della mammella sono costituite dalle mutazioni frameshift e da quelle nonsense, che causano la produzione di una proteina tronca e quindi non funzionale. In seguito alla scoperta, negli anni ’90, di BRCA1 e BRCA2, la possibilità di identificare i soggetti che sono predisposti a sviluppare carcinomi della mammella e/o dell’ovaio ha portato all’implementazione di test molecolari per la rilevazione di mutazioni deleterie in BRCA1 e BRCA2 e la successiva consulenza genetica dei soggetti portatori di mutazione. Fino ad oggi, il sequenziamento diretto costituisce il metodo d’elezione per l’analisi completa dei due geni in questione, tuttavia esso risulta alquanto dispendioso sia in termini economici che di tempo e per questo motivo nel corso degli anni sono state utilizzate delle tecniche di indagine molecolare volte ad uno screening pre-sequenziamento. Tra le varie tecniche che sono state adottate, ricordiamo la Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), il Protein Truncation Test (PTT), la Conformation-Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE) e la Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC). La DHPLC risulta senza dubbio la migliore in termini di sensibilità e costi, per cui negli ultimi anni la DHPLC si è affermata come tecnica principale ai fini di screening molecolare di BRCA1 e BRCA2. Presso i laboratori del CEINGE è stata messa a punto una metodica per l’identificazione di mutazioni in BRCA1 e BRCA2. Sono stati utilizzati, ai fini dell’ottimizzazione, 53 soggetti di controllo dell’archivio di Fibrosi Cistica del CEINGE di Napoli e 15 pazienti HBOC provenienti dall’Istituto Oncologico Giovanni Paolo II di Bari, che erano stati precedentemente sottoposti a screening per mutazioni in 6 BRCA1 e BRCA2. Dopo aver ottimizzato le condizioni per l’amplificazione di BRCA1 e BRCA2, i campioni di DNA, estratti da sangue periferico e appartenenti ai 53 soggetti di controllo di Napoli ed ai 15 soggetti HBOC di Bari, sono stati analizzati utilizzando la metodica combinata DHPLC/ nucleasi SURVEYOR®, che è basata sul metodo di sizing in condizioni non-denaturanti, piuttosto che sulle Temperature di Melting (Tm). In pratica, gli ampliconi sono analizzati in DHPLC alla temperatura di 45°C, e sono visualizzati, se wild type, con un singolo picco o, in presenza di mutazioni, con multipli picchi corrispondenti all’amplicone wild type non digerito dall’enzima e ai frammenti di amplicone con eteroduplex che derivano dal taglio enzimatico. La metodologia combinata DHPLC/SURVEYOR® è stata ottimizzata prima su singoli ampliconi, poi è stato ideato un protocollo che consentisse di analizzare più ampliconi simultaneamente, secondo un approccio “multiamplicon”. Tutti i campioni che hanno presentato cromatogrammi compatibili con la presenza di variazioni di sequenza sono stati analizzati mediante sequenziamento diretto allo scopo di caratterizzare le varianti di sequenza identificate. In seguito all’analisi dei campioni che sono stati sequenziati, possiamo affermare che la metodica combinata DHPLC/SURVEYOR® si è rivelata estremamente sensibile, poiché è stata confermata la presenza di polimorfismi e mutazioni in tutti i campioni il cui cromatogramma risultava alterato. In particolare, sono state identificate nei soggetti di controllo 42 varianti geniche, 19 su BRCA1 e 23 su BRCA2, tra cui 26 polimorfismi, 10 UnClassified Variants (UCVs) e 6 nuove varianti, 3 introniche, una esonica, una in 5’UTR ed una in 3’UTR. Nei 15 pazienti HBOC di Bari sono state rilevate tutte le 10 varianti di sequenza che erano precedentemente state identificate presso il centro di Bari. Allo stato attuale, è in corso una fase di reclutamento di pazienti della regione Campania sia con diagnosi clinica di HBOC, sia con carcinoma della mammella di tipo sporadico, da utilizzare come controlli. Fondamentali si sono rivelate, in questa fase progettuale, le collaborazioni con l’Istituto Nazionale Tumori- Fondazione G. Pascale di Napoli ed il Dipartimento Universitario di Chirurgia Generale, Geriatrica, Oncologica e Tecnologie Avanzate della Facoltà di Medicina e Chirurgia della Università degli Studi di Napoli “Federico II”. Per poter ottenere quante più informazioni possibili riguardo le pazienti reclutate, è stato creato un apposito questionario anamnestico, da sottoporre ai soggetti che daranno il consenso a partecipare a questo studio epidemiologico a scopo di ricerca. Le 10 pazienti reclutate finora sono già state sottoposte ad indagine molecolare per la ricerca di mutazioni in BRCA1 e BRCA2. In una di queste pazienti è stata identificata una mutazione deleteria, la p.K2013X, nota sia in letteratura che sul database BIC. La mutazione p.K2013X causa la creazione di un codone di stop, per cui ne risulta la produzione di una proteina tronca e non funzionale e la probabile soppressione di un sito di legame con la proteina Rad51, legame necessario per l’attività di ricombinazione omologa e riparazione dei danni al DNA. Poiché, in base a dati di letteratura, sono state riscontrate mutazioni su BRCA1 e BRCA2 soltanto nel 20% di tutti i casi di HBOC, intendiamo approfondire gli studi molecolari sul carcinoma della mammella e dell’ovaio in particolare sui soggetti clinicamente affetti da HBOC che risulteranno negativi allo screening di BRCA1 e BRCA2, prendendo in considerazione anche altri tipi di target molecolare come ad esempio i microRNA ed il trascrittoma.

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