Cozzolino, Flora (2009) La proteomica nello studio dei meccanismi molecolari di fenomeni patologici. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Item Type: Tesi di dottorato
Uncontrolled Keywords: Spettrometria di massa, Proteomica Funzionale.
Date Deposited: 03 Aug 2010 14:29
Last Modified: 30 Apr 2014 19:41
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/4279

Abstract

Una completa descrizione della complessa rete di meccanismi cellulari e l’uso di network per predire la maggior parte dei comportamenti cellulari sono i principali obiettivi della system biology. Un ruolo di chiave nella biologia contemporanea è svolto dalla proteomica funzionale che si propone di fornire delucidazioni sulle funzioni delle proteine e sulla definizione dei meccanismi cellulari a livello molecolare. Il conseguimento di questi obiettivi dipendende principalmente dall'identificazione di proteine all'interno di complessi funzionali in vivo. Isolare proteine che interagiscono tra loro, dipende da procedure di cromatografia di affinità o di immuno-precipitazione nelle quali l'esca proteica ed i suoi specifici partners possono essere isolati utilizzando uno specifico ligando immobilizzato su supporti solidi insolubili. Questi approcci conducono all’identificazione di molte proteine che appartengono a complessi distinti dotati di funzioni biologiche diverse. Attribuire l’appartenenza di ogni proteina ad un specifico complesso costituisce un ingente problema che può essere solo parzialmente risolto usando database di interazione proteina-proteina ed informazioni di letteratura. È possibile che lo sviluppo delle metodologie di pre-frazionamento per separare complessi proteici preservando le loro interazioni native rappresenti una soluzione essenziale per il futuro della proteomica funzionale. La pre-purificazione dei complessi può essere intrapresa solamente in condizioni native sulla base delle loro caratteristiche chimico-fisiche, i.e. grandezza e dimensione (cromatografia di gel-filtrazione), la densità (ultracentrifugatione), ecc. pre-frazionamento. In seguito al pre-frazionamento, il complesso associato ad una specifica funzione biologica può essere isolato usando tecniche di purificazione per affinità. Approcci di proteomica funzionale capaci di descrivere singole proteine appartenenti a complessi coinvolti in specifiche funzioni cellulari avrà un impatto terrificante su futuri studi della system biology. In particolare il progetto di tesi di dottorato si è articolato nei seguenti punti:  Studio degli interattori molecolari di h-Prune mediante approcci di proteomica funzionale.  Studio dell’interattoma della proteina PED/PEA-15 mediante metodologia di Tandem Affinity Purification.  Identificazione degli interattori molecolari della proteina umana SOCS1 mediante approcci di proteomica funzionale. A.1.Studio degli interattori molecolari di h-Prune mediante approcci di proteomica funzionale La diffusione metastatica è la maggiore causa di morte per il cancro al seno. Questo fenomeno è dovuto alla capacità di una cellula di invadere i tessuti circostanti ed è dovuto ad un network molecolare altamente complesso. Le cellule metastatiche cambiano le loro proprietà adesive, perdono i contatti con le altre cellule nel tumore primario e creano nuovi contatti con la matrice extracellulare dei tessuti ospiti con i quali si imbattono appena li invadono. Le cellule tumorali per allontanarsi dal tumore primario, hanno bisogno di incrementare le loro funzioni di motilità. Queste proprietà sono fornite dalle cellule metastatiche che si diffondono attraverso i sestemi linfatico e vascolare. La proteina umana Prune, è una fosfodiesterasi appartenente alla famiglia delle DHH, lega nm-23-H1 un soppressore metastatico. Precedenti studi hanno dimostrato che l’overespressione di h-prune nella linea cellulare MDA-MB-435 di carcinoma mammario, causa un sostanziale decremento di AMP ciclico e un incremento di motilità cellulare. Per identificare i partners di h-prune in cellule mammarie tumorali e fare un’ipotesi circa un potenziale network di interazione attraverso cui h-prune esercita il suo ruolo, sono stati eseguiti esperimenti di immunoprecipitazione seguiti da analisi con spettrometria di massa. Tra le proteine identificate c’è Gelsolin, un’actin binding protein la cui attività è Ca2+ e fosfolipide dipendente. Essa lega l’Actina regolandone la strutturazione, infatti può interrompere o contribuire alla polimerizzazione di filamenti di actina o anche fungere da “tappo” impedendo l’allungamento del filamento stesso ad una estremità. È noto, da dati presenti in letteratura, che nelle cellule tumorali c’è una scarsa presenza di Gelsolin e che in cellule in cui è stata silenziata l’espressione di Gelsolin, interviene un processo che comporta una ridotta adesione cellulare ed un aumento della motilità. Al momento non è chiaro in quale fase dello sviluppo del tumore si formi il complesso Prune-Gelsolin, e se sia la formazione di questo complesso ad attivare la cascata di segnali che porta all’invasione del tumore, oppure in qualche modo Prune, formando il legame con Gelsolin, sottragga la proteina stessa al sistema dando il via ad un segnale cellulare che termina con lo sviluppo di metastasi riproducendo quindi un caso analogo al silenziamento del gene. A.2.Studio dell’interattoma della proteina PED/PEA-15 mediante metodologia di Tandem Affinity Purification. La Psoriasi è una dermatite infiammatoria cronica caratterizzata da iperproliferazione dei cheratinociti. Le lesioni della pelle sono infiltrate da cellule T, che secernono interferone gamma (IFN-γ) e si pensa siano necessarie per mantenere il fenotipo psoriatico. In normali cheratinociti l’IFN-γ è un potente inibitore di proliferazione delle citochine. Le citochine appartengono ad un’ampia famiglia di glicoproteine secrete che regolano processi biologi fondamentali, quali immunità ed ematopoiesi. Le citochine trasmettono informazioni biologiche alle cellule target attraverso il loro legame ai recettori di membrana. Sebbene i recettori di citochine mancano di attività chinasica intrinseca, questa viene loro fornita dall’associazione con le proteine JAK (janus activated kinase). SOCS1 appartiene alla famiglia dei soppressori del segnale citichinico che comprende otto membri, SOCS1-SOCS7 e CIS. Strutturalmente la proteina è composta da un dominio KIR (Kinase Inhibitory Region), costituito da 24 amminoacidi, un dominio centrale SH2 (SRC-Homolougus domain), e una regione conservata definita SOCS-Box al carbossiterminale. SOCS1 non è espressa dal tessuto normale ma lo è altamente in tessuti psoriatici. L’overespressione di SOCS1 in cloni stabili di cheratinociti inibisce la fosforilazione IFN-γ-induced del recettore dell’IFN-γ (IFN-γRα) e l’attivazione di STAT1 e STAT3. SOCS1 potrebbe rappresentare un nuovo approccio terapeutico per malattie della pelle dipendenti dall’IFN-γ. La proteina ricombinante, avente un tag peptidico (Myc) all’estremità N-terminale, è stata espressa in cellule di cheratinociti e i complessi contenenti SOCS1 isolati mediante immunoprecipitazione con anticorpi anti-myc. Le proteine sono state frazionate ed identificate come descritto. I risultati ottenuti forniscono un quadro complesso di interattori appartenenti a classi funzionali diverse. Tra gli altri componenti, l’attenzione si è focalizzata sulla proteina Rabaptin 5β, una proteina di recente scoperta, effettore della GTPasi Rab5 ed appartenente alla superfamiglia di Ras, coinvolta principalmente nel trafficking endosomiale. Dati sperimentali suggeriscono che SOCS1 venga reclutato da Rabex 5, Rab 5 e Rabaptin 5β in un meccanismo di trafficking vescicolare endocitotico che rappresenta un possibile meccanismo di controllo della concentrazione citosolica di SOCS1, importante per il ruolo regolatorio di questa proteina nel signalling citochinico. A.3.Identificazione degli interattori molecolari della proteina umana SOCS1 mediante approcci di proteomica funzionale. PED, (phosphoprotein arricchita nel diabete), anche nota come PEA15, (fosfoproteina arricchita in astrociti), è una piccola proteina 15 di kDa coinvolta in molti pathways cellulari, fra questi apoptosi, autofagia, sopravvivenza, proliferazione e migrazione [1-3]. Prima fu identificata come una fosfoproteina espressa in astrociti e poi fu trovata overespressa in pazienti con diabete di tipo II. La funzione di PED è regolata dalla fosforilazione su due residui di serine diversi: Ser104 fosforilata da PKC (la Proteina Kinase C) e Ser116 fosforilata da AKT/PKB (la Proteina Kinase B) e CamKII (Calcio Calmodulin Kinase II). PED è un membro della famiglia delle proteine contenenti il Dominio Effettore di Morte (DED). Questi domini furono descritti regolare la morte cellulare attraverso interazione proteina-proteina. In particolare, PED fu descritto inibire la formazione del DISC (Morte che Incita Signaling Complex) e l’attivazione della caspase 8 su stimolazione delle citochine di morte (FasL, TNFα, TRAIL) in tipi di cellule diversi. Inoltre, Hao e collaboratori trovarono un aumento dell’espressione di PED in linee cellulari di glioma primario. I meccanismi molecolari che regolano l'espressione di PED in cancri umani sono ancora poco chiari. I recenti studi rivelano che l'espressione di PED può essere regolata da molti fattori di trascrizione. PED interagisce con molecole diverse, fra questi ERK 1/2. PED non è un substrato di ERK 1/2 ma aumenta la loro fosoforilazione, ed altera la loro localizzazione nucleare sequestrandoli nel cytosol e prevenendo la loro traslocazione nucleare. Inoltre PED aumentando la fosforilazione delle ERKs agisce come una proteina scaffold per RSK2 ed ERK 1/2 e migliora il signalling di Ras. Per estendere le informazioni su PED ed il suo ruolo nel cancro abbiamo tentato di trovare gli interattori di PED attraverso la metologia di Tandem Affinity Purification (TAP-Tag). Questo protocollo fu prima testato in lievito ma è anche applicabile in cellule eucariotiche. Il TAP-Tag è costituito da due differenti “tags” di affinità, la PROTEINA A dello Staphylococcus aureus, che è specificamente riconosciuta dalle immunoglobuline G, e il Calmodulin Binding Peptide (CBP), peptide sensibile ai livelli intracellulari di calcio e capace di interagire fortemente con la Calmodulina. Le regioni codificanti per i due tags sono separate da un sito di idrolisi per la proteasi del virus del tabacco TEV una proteasi estremamente specifica. Dall'analisi di spettrometria di massa, noi abbiamo identificato molti interattori nuovi. In questo lavoro di tesi abbiamo descritto l'interazione tra PED e Rac1, un membro della famiglia di proteine di Rho GTPase che trasforma lo stato di GTP attivo ad un stato di GDP inattivo. Rac1 lega una varietà di proteine effettrici regolando così una larga serie di effetti cellulari come processi di secrezione, fagocitosi di cellule apoptotiche, polarizzazione di cellule epiteliali, regola la formazione di fattori inducenti la crescita dei ruffles di membrana, la generazione di ROS, la formazione di lamellipodia e migrazione cellulare. Si è investigato l'effetto della sovraespressione di PED su Rac1 GTP/GDP, gli effetti dell'attivazione di Rac1 sulla fosforilazione di PED e gli effetti di questa interazione a valle, concentrando la nostra attenzione sul processo di migrazione cellulare.

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