Leonardo, Rosalia (2006) Studi molecolari di PLAUF, una RNA-binding protein in riccio di mare. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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La regolazione dell'espressione genica a livello post-trascrizionale consiste in una serie di eventi mediati da una complessa rete di interazioni RNA/proteine che dipendono dal riconoscimento di uno specifico mRNA da parte delle RNA binding proteins (RNA-BPs). Nel riccio di mare P. lividus il trascritto che codifica per la variante dell’istone H3.3 è caratterizzato da una lunga 3’UTR che contiene motivi ARE (AU-Rich element) a cui sembrano legarsi almeno tre diverse proteine (45, 32 e 21 kDa); tale legame potrebbe essere implicato nella regolazione dell’emivita del trascritto. Nel gruppo diretto dalla Prof.ssa L. Fucci era stato in precedenza isolato un cDNA codificante per la proteina PLAUF, così chiamata perchè omologa alle proteine della famiglia AUF1 identificate in ratto e uomo, che sono implicate nell'emivita di trascritti contenenti motivi AU-rich. Esperimenti di Northern blotting avevano rivelato la presenza di almeno tre trascritti per PLAUF a diverso peso molecolare. Allo scopo di caratterizzare tali trascritti, dopo aver definito la presenza di un sito unico di inizio trascrizione, sono stati eseguiti esperimenti di 3’Race ed analisi di una nuova library di espressione. Tali approcci hanno dimostrato che i tre trascritti si differenziano per la lunghezza della 3'UTR e quindi deriverebbero dall'utilizzo di siti alternativi di poliadenilazione. Inoltre attraverso esperimenti di RT-PCR, è stata dimostrata la presenza di un ulteriore forma di trascritto generato per splicing alternativo che produce una proteina più corta di 23 aminoacidi. Si è passati quindi a identificare e analizzare il gene per PLAUF, attraverso lo "screening" di una library genomica. Il gene è risultato diviso in 10 esoni e 9 introni e l’esone 9 è quello che può essere allontanato mediante splicing alternativo. Sulla base di diversi approcci sperimentali la proteina PLAUF potrebbe corrispondere alla proteina da 32 kDa che lega la 3’UTR del trascritto per l’istone H3.3, influenzandone l’emivita. La proteina di fusione GST-PLAUF è stata quindi espressa in vitro e purificata, ne è stata analizzata la capacità di legare la 3'UTR dell'istone H3.3 e di influenzarne l'emivita. Essa lega specificamente in vitro la 3'UTR dell'istone H3.3 e sembra proteggere il trascritto dalla degradazione. E' stato quindi necessario preparare anticorpi contro PLAUF per correlare la proteina PLAUF ai dati ottenuti con gli estratti proteici da embrioni di P. lividus e quindi alla proteina da 32 kDa. Esperimenti di Western blotting hanno identificato una proteina di 32 kDa nell'estratto proteico da embrioni di riccio di mare allo stadio di gastrula. Inoltre, in esperimenti di Supershift, gli anticorpi anti-PLAUF hanno identificato la proteina nel complesso di legame al trascritto per l’istone H3.3. Quindi la proteina PLAUF corrisponde alla proteina da 32 kDa capace di legare il trascritto per H3.3 e di influenzarne l'emivita. Inoltre esperimenti di ibridazioni in situ hanno dimostrato che gli mRNA per PLAUF e per H3.3 colocalizzano in embrioni a diversi stadi di sviluppo. In conclusione tutti i dati riportati suggeriscono che PLAUF potrebbe legare anche in vivo la 3’UTR dell’istone H3.3 e regolarne l’emivita. Inoltre questi risultati dimostrano che PLAUF conserva con le proteine AUF1 parte della sequenza aminoacidica, l’organizzazione del gene e anche probabilmente la funzione biologica, nonostante ci siano state sostituzioni di domini.

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