Apicella, Elisa (2010) Un biosensore a fluorescenza per un rapido screening ed il follow-up di pazienti celiaci. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Abstract

La celiachia è una particolare intolleranza alimentare che comporta un’enteropatia autoimmune cronica a danno dell’intestino tenue. È una malattia particolarmente diffusa nel mondo occidentale e sebbene ci sia una chiara predisposizione familiare, l’ereditarietà, non segue i classici pattern mendeliani, suggerendo un’eziopatogenesi multigenica e/o multifattoriale fondamentalmente legata a due fattori: uno intrinseco al paziente, rappresentato dalla predisposizione genetica, che è per lo più legata al gene HLA DQ2/8; uno esogeno o, meglio, ambientale, legato all’assunzione, attraverso la dieta, di glutine, componente proteica contenuta in diversi cereali. La frazione tossica di tale proteina è rappresentata dalla componente alcool solubile: la gliadina, caratterizzata dalla frequente ricorrenza del tetrapeptide -gln-gln-gln-pro-, ora considerato l’agente lesivo della malattia. Infatti, le gravi lesioni alla mucosa dell’intestino tenue causate dall’intolleranza al glutine, regrediscono solo dopo l’eliminazione di tale nutriente dalla dieta. Oggi, la diagnosi definitiva di celiachia può essere ottenuta solo attraverso l’esame istopatologico della mucosa digiunale volto a rilevare l’atrofia dei villi intestinali. Tuttavia, la possibilità di avere metodi più pratici e meno invasivi rispetto a quelli istopatologici, può rappresentare una prospettiva importante al fine di eseguire “screening” di massa e per il “follow-up” della malattia celiaca. Da questo punto di vista, diversi sistemi ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) sono stati messi a punto per il dosaggio di anticorpi anti-transglutaminasi tissutale (Ab anti-tTG), rappresentanti un marker sierologico per la celiachia (Dieterich W. et al., 1997; 2001). Perciò, lo sviluppo di un sistema di analisi quantitativo più semplice e rapido, quale un biosensore proteico, che sfrutti i principi della fluorescenza, per la determinazione degli Ab anti-tTG, è da considerarsi molto utile e innovativo tanto da rappresentare l’obiettivo prioritario del seguente lavoro di ricerca. L’aspetto chiave di tale tecnologia è racchiuso nella capacità di produrre un segnale luminoso, quando sono rilevati tali anticorpi nel siero o nella saliva dei pazienti affetti, tanto da metterli in condizione di seguire il “follow-up” della malattia in modo semplice e immediato. In particolare, tale lavoro ha previsto la messa a punto di un saggio fluorescente competitivo basato sulla simultanea applicazione di due metodologie: la “FRET” (Fluorescence Resonance Energy Transfer) e la tecnica “molecular beacons”. Queste metodiche utilizzano la presenza di opportune sonde fluorescenti coniugate a due differenti molecole biologiche, nel caso specifico la transglutaminasi da fegato di Guinea pig (gptTG) e gli anticorpi anti-tTG da coniglio e tengono conto della “distanza di Förster” in cui avviene trasferimento di energia tra i fluorofori utilizzati. In un primo momento i saggi di FRET, volti a studiare le interazioni Ag-Ab in soluzione, sono stati eseguiti mediante l’acquisizione di misure di fluorescenza statica (steady-state) e risolta nel tempo (lifetime). Dopo di che, al fine di simulare i regolari saggi immuno-enzimatici eseguiti su piastre multi-pozzetto, tali misure sono state effettuate sui campioni marcati, immobilizzati in maniera non covalente su vetrino, in modo tale da sviluppare un saggio fluorescente di tipo “front-face”. Tale configurazione con l’ausilio della Microscopia Confocale in Fluorescenza ha permesso di studiare le dinamiche interazionali di singole molecole di Ag legate agli Ab anti-tTG. Inoltre, al fine di ottimizzare la tecnica di fluorescenza, in modo da ottenere un basso “background”, un’alta sensibilità e specificità, i campioni sono stati immobilizzati su vetrini prima ricoperti con particelle metalliche d’argento, formanti strutture ramificate visibili a occhio nudo (fractal-like structures). Questo perché è stato osservato, che le caratteristiche spettrali dei fluorofori, possono cambiare in maniera rilevante quando si trovano in stretta vicinanza di una superficie metallica, tanto da produrre un aumento dell’emissione del segnale fluorescente che può essere utilizzato per migliorare la determinazione quantitativa di bioanaliti. Parallelamente, al fine di abbattere gli alti costi delle preparazioni di gptTG commercialmente disponibili, l’attività sperimentale ha previsto la realizzazione di un’opportuna strategia di clonaggio del gene della tTG da Guinea pig e di un efficiente sistema di espressione della proteina ricombinante in un ceppo batterico di Escherichia coli. I risultati ottenuti hanno dimostrano che la scelta dei fluorofori utilizzati per marcare l’Ag commerciale e gli Ab-anti tTG da coniglio è stata corretta. Infatti, si è verificato il trasferimento di energia di risonanza tra gli immunoreagenti selezionati, fenomeno su cui si basa il saggio a fluorescenza proposto. Inoltre, il principio della fluorescenza aumentata dai metalli è stato utile a migliorare la rilevazione del bioanalita d’interesse, registrando un aumento considerevole dell’emissione di fluorescenza di singole molecole di Ag marcato, immobilizzato su vetrino ricoperto da nanostrutture d’argento ramificate, migliorando la sensibilità del saggio fluorescente progettato. Per contro, sono necessari altri studi per ottimizzare le condizioni di espressione della gptTG ricombinante in E. coli, poiché la quantità di enzima solubile prodotta, in presenza di chaperoni chimici, non è sufficiente per passare alla procedura di purificazione. Perciò, l’uso di chaperoni molecolari esogeni, come supporto per indurre un corretto ripiegamento della struttura proteica, potrebbe essere una buona strategia per ottenere elevate quantità di proteina solubile ricombinante in E. coli.

Item Type: Tesi di dottorato
Uncontrolled Keywords: celiachia, biosensore, fluorescenza
Depositing User: Francesca Migliorini
Date Deposited: 14 Dec 2010 11:39
Last Modified: 30 Apr 2014 19:44
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/8099

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