Cozzolino, Marianna (2010) Identificazione di complessi proteici coinvolti in specifici processi cellulari. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Item Type: Tesi di dottorato
Uncontrolled Keywords: Proteomica Funzionale
Date Deposited: 02 Dec 2010 08:02
Last Modified: 30 Apr 2014 19:44
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/8109

Abstract

Una completa descrizione della complessa rete di meccanismi cellulari e l’uso di network per predire la maggior parte dei comportamenti cellulari sono i principali obiettivi della system biology. Un ruolo chiave nella biologia contemporanea è svolto dalla proteomica funzionale che si propone di fornire delucidazioni sulle funzioni delle proteine e sulla definizione dei meccanismi cellulari a livello molecolare. Il conseguimento di questi obiettivi dipende principalmente dall'identificazione di proteine all'interno di complessi funzionali in vivo. L’isolamento delle proteine che interagiscono tra loro è effettuato mediante procedure di cromatografia di affinità o di immuno-precipitazione nelle quali l'esca proteica ed i suoi specifici partners possono essere isolati utilizzando uno specifico ligando immobilizzato su supporti solidi insolubili. Questi approcci conducono all’identificazione di molte proteine che appartengono a complessi distinti dotati di funzioni biologiche diverse. Attribuire l’appartenenza di ogni proteina ad un specifico complesso costituisce un ingente problema che può essere solo parzialmente risolto usando database di interazione proteina-proteina ed informazioni di letteratura. È possibile che lo sviluppo delle metodologie di pre-frazionamento per separare complessi proteici preservando le loro interazioni native rappresenti una soluzione essenziale per il futuro della prote-omica funzionale. La pre-purificazione dei complessi può essere intrapresa solamente in condizioni native sulla base delle loro caratteristiche chimico-fisiche, come la grandezza e dimensione (croma-tografia di gel-filtrazione), la densità (ultracentrifugatione), ecc. In seguito al pre-frazionamento, il complesso associato ad una specifica funzione biologica può essere isolato usando tecniche di puri-ficazione per affinità. Approcci di proteomica funzionale capaci di descrivere singole proteine appartenenti a complessi coinvolti in specifiche funzioni cellulari avrà un forte impatto su futuri studi della system biology. In particolare il progetto di tesi di dottorato si è articolato nei seguenti punti: Studio del “traffico” molecolare di SUMF1. Studio dell’interattoma del fattore trascrizionale CBX7. Messa a punto di strategie di pre-frazionamento di complessi proteici. A.1. Studio del “traffico” molecolare di SUMF1 SUMF1 è una proteina del reticolo endoplasmatico (RE) capace di attivare tutte le solfatasi median-te la modifica post- traduzionale di una cisteina presente nel loro dominio catalitico in formilglicina. Questa unica modifica è essenziale per l’attività delle solfatasi. Infatti, mutazioni nel gene di SUMF1 rendono inattive tutte le solfatasi causando una grave malattia, la Multiple Sulfatase Defi-ciency (MSD), che colpisce diversi organi e tessuti, soprattutto quello nervoso. Studi precedenti hanno dimostrato che SUMF1 può essere secreta nel mezzo di coltura cellulare e poi reinternalizzata da altre cellule che la localizzano nuovamente nel RE, dove attiva le solfatasi endogene. Tuttavia, i pathways molecolari attraverso cui SUMF1 è secreta dalle cellule o è reinternalizzata dal mezzo sono ancora in gran parte sconosciuti. Per delucidare il meccanismo che controlla il trafficking e la funzione di SUMF1, sono stati identificati i partners della proteina mediante esperimenti di immu-noprecipitazione seguiti da analisi con spettrometria di massa. In particolare la proteina SUMF1, coniugata al peptide FLAG, è stata espressa in una linea cellulare umana. Tali cellule sono state poi lisate ed il complesso o i complessi sovramolecolari coinvolgenti l’esca, sono stati purificati mediante cromatografia di affinità. Quest’ultima prevede il riconosci-mento specifico del peptide FLAG, coniugato all’esca, mediante un anticorpo legato covalentemen-te ad un supporto solido di agarosio. Le miscele proteiche, dell’immunoprecipitato e di un opportuno controllo, costituito dall’immunoprecipitato derivante da cellule non sovraesprimenti la proteina esca coniugata con il FLAG, sono state poi frazionate mediante elettroforesi monodimensionale e il gel colorato con Comassie colloidale. Le bande proteiche contenenti i campioni sono state escisse dal gel, ridotte, alchilate e digerite in situ con tripsina. La miscela di peptidi risultante è stata sottoposta a esperimenti di LCMSMS che abbinano procedure di cromatografia liquida capillare con analisi mediante spettrometria di massa tandem. Mediante quest’ultimo approccio è stato possibile ottenere informazioni relative alla sequenza di uno o più frammenti proteolitici e quindi risalire all’identificazione delle proteine che interagiscono specificamente con SUMF1. I dati ottenuti hanno consentito di identificare alcuni partners molecolari della proteina esca, quali PDI, ERp44 and ERGIC-53, consentendo di definire il percorso molecolare di SUMF1 durante il processo di secre-zione. A.2 Studio dell’interattoma del fattore trasrizionale CBX7. Nel secondo anno di Dottorato l’attività scientifica è stata indirizzata all’impiego delle metodologie di proteomica funzionale per l’identificazione dei partners molecolari del fattore trascrizionale Cbx7 (Chromobox protein homologue 7), una proteina di 251 amminoacidi che possiede un chromodomain nella regione N-terminale. Cbx7 è una proteina appartenente alla famiglia delle chromobox e membro del polycomb repressive complex 1 che, insieme con il polycomb repressive complex 2, inibisce l’espressione di specifici geni. La forma murina di Cbx7 può associarsi facoltativamente all’eterocromatina e al cromosoma X inattivo, suggerendo un eventuale ruolo nella repressione della trascrizione genica. E’ stato recentemente dimostrato che il gene cbx7 è drasticamente down-regolato in sei diverse linee cellulari con carcinoma tiroideo. Inoltre, l’analisi dell’espressione di Cbx7 in un numero elevato di campioni di carcinoma tiroideo rivela una progressiva riduzione dei livelli di Cbx7 che risulta quindi correlato con il grado di malignità delle neoplasie tiroidee. Altri studi correlano addirittura la bassa espressione di Cbx7 con una ridotta sopravvivenza in pazienti con carcinoma al colon. Il ripristino dell’espressione di Cbx7 nelle cellule con cancro tiroideo riduce la loro velocità di crescita, indicando che Cbx7 gioca un ruolo critico nella regolazione della proliferazione delle cellule tiroidee trasformate. Per delucidare il meccanismo attraverso cui la ridotta concentrazione del fattore Cbx7 è coinvolta nella carcinogenesi sono stati isolati ed identificati i complessi proteici che la coinvolgono. In parti-colare la proteina Cbx7, coniugata al peptide V5, è stata sovraespressa in una linea cellulare umana. Tali cellule sono state poi lisate ed il complesso o i complessi sovramolecolari coinvolgenti l’esca, sono stati purificati mediante immunoprecipitazione grazie ad un anticorpo specifico per il peptide V5 legato covalentemente ad un supporto solido di agarosio. Le miscele proteiche, dell’immunoprecipitato e di un opportuno controllo, costituito da cellule non esprimenti la proteina esca coniugata con il V5, sono state poi frazionate mediante elettroforesi monodimensionale e le bande proteiche contenenti i campioni, dopo colorazione con Comassie colloidale, sono state escisse dal gel, ridotte, alchilate e digerite in situ con tripsina. La miscela di peptidi risultante è stata sotto-posta a esperimenti di LCMSMS che abbinano procedure di cromatografia liquida capillare con ana-lisi mediante spettrometria di massa tandem. Mediante quest’ultimo approccio è stato possibile otte-nere informazioni relative alla sequenza di uno o più frammenti proteolitici e quindi risalire all’identificazione delle proteine che interagiscono specificamente con Cbx7. I dati ottenuti hanno consentito di definire alcuni nuovi partners molecolari della proteina Cbx7. Tra di essi è stata studiata in particolare l’interazione con l’istone deacetilase 2 (HDAC2). Tale proteina gioca un ruolo chiave nella trasformazione delle cellule neoplastiche e nella down-regolazione dell’espressione di E-cadherin, evento frequente durante la progressione del tumore. E’ stato dimostrato che Cbx7 interagisce con HDAC2 e ne inibisce l’attività. Inoltre entrambe le proteine legano il promotore dell’E-cadherin, ma esercitano funzioni diametralmente opposte. Infat-ti, il legame di Cbx7 decresce l’effetto di inibizione esercitato da HDAC2 sull’espressione di E-cadherin. Quindi, la riduzione dei livelli di espressione di Cbx7 in cellule tumorali potrebbe com-portare una ridotta capacità della cellula di regolare positivamente l’espressione di E-cadherin, ini-bita da HDAC2, e quindi correlare con un fenotipo maligno in pazienti affetti da malattie neoplasti-che. A.3 Messa a punto di strategie di pre-frazionamento di complessi proteici. L’esperimento di proteomica mediante il quale si è cercato di delucidare il meccanismo attraverso cui il fattore Cbx7 controlla la proliferazione cellulare, ha fornito una lunga lista di putativi interat-tori del fattore trascrizionale, indicando chiaramente che Cbx7 è coinvolta in numerosi complessi probabilmente dotati di diversa funzione biologica. Come in altre applicazioni di proteomica, il compito più impegnativo in questi esperimenti è l'interpretazione dei dati e in particolare il tentativo di assegnare i singoli componenti proteici allo specifico complesso cui essi appartengono, risalendo quindi alla funzione biologica dell’intero complesso. Nonostante la ricchezza delle informazioni fornite da banche dati di proteine e database di interazioni proteina-proteina e la disponibilità di strumenti software, la deduzione di un significato biologico dalla lista degli interattori rimane ancora un problema di difficile soluzione. Queste difficoltà potrebbero essere superate dall’impiego di tecniche di pre-frazionamento dell’estratto proteico di partenza in grado di preservare le interazioni native tra le proteine. In tal modo si tenderebbe ad isolare i singoli complessi funzionali ridimensio-nando la complessità dei dati di proteomica funzionale. La pre-purificazione dei singoli complessi coinvolgenti CBX7 è stata realizzata sulla base delle loro caratteristiche chimico-fisiche, sfruttando le dimensioni e la forma o la densità diverse dei vari complessi. L’estratto nucleare totale è stato quindi preventivamente sottoposto a frazionamento me-diante cromatografia ad esclusione molecolare o ultracentrifugazione in gradiente di glicerolo.. Le diverse frazioni ottenute da queste pre-purificazioni sono state analizzate utilizzando un anticorpo anti-V5, per individuare quelle contenenti Cbx7. Le frazioni positive all’immunorivelazione sono state selezionate, mentre le altre sono state scartate, ed i complessi multiproteici sono stati singo-larmente isolati mediante immunoprecipitazione. La diminuzione della complessità dell’estratto proteico nucleare con queste procedure ha comportato una notevole diminuzione delle proteine non specifiche abbassando notevolmente il rischio di identificazione di falsi positivi. Inoltre, tutti i par-tners localizzati nella stessa frazione appartengono verosimilmente allo stesso complesso funzionale, rendendo così l'interpretazione dei dati molto più semplice. In particolare, dall’esperimento di ultracentrifugazione in gradiente di glicerolo sono stati identificati una serie di componenti del complesso PRC1 quali BMI-1, hPH1, hPH2, hPH3, RING1B, in ottimo accordo con quanto riportato in letteratura. Il complesso PRC1 è formato da almeno un rappre-sentante di ciascuna delle quattro famiglie di proteine altamente conservate che ne costituiscono il core: Polycomb (CBX2/4/6/7/8), Polyhomeotic (HPH1/2/3), Posterior sex combs (PSC1-6) e Sex combs extra (RING 1A/1B). In aggiunta alle quattro subunita’ del core di PRC1, è stato riportato che anche altre proteine associano con il complesso come BCOR, che è capace di intervenire nell’ubiquitinazione di H2A. La cromatografia ad esclusione molecolare, invece, ha portato all’identificazione di proteine coin-volte nel processing dell’RNA, molte delle quali appartenenti al complesso di splicing, suggerendo che CBX7 sia strettamente connessa con l’RNA. Sta diventando, infatti, sempre più evidente che i processi di regolazione della cromatina, di trascrizione e splicing sono strettamente connessi. Seb-bene sia noto che CBX7 si associa alla cromatina in maniera RNA dipendente, non è chiaro se quest’interazione sia diretta o indiretta. Il ritrovamento di proteine che legano l’RNA potrebbe far supporre che il legame sia indiretto mediato da tali proteine.

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