Aria, Valentina (2010) Analisi strutturale e funzionale del complesso Tim/Tipin umano. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Tim e Tipin sono fattori che appartengono ad una famiglia molto conservata, infatti ortologhi di queste proteine sono stati ritrovati in tutti gli eucarioti, come ad esempio in Saccharomyces cerevisiae, in Xenopus laevis, ed in uomo. Essi formano un complesso durante tutte le fasi del ciclo cellule e dipendono l’uno dall’altro per la loro localizzazione nucleare e per la loro stabilità. Tim e Tipin sono entrambi implicati nella risposta al checkpoint della fase S mediata dalla chinasi ATR in quanto mediano la fosforilazione della chinasi Chk1 in presenza di un danno al DNA. Il complesso Tim/Tipin è anche importante per la corretta progressione della forca replicativa in condizioni di replicazione non perturbate, agendo come un ponte molecolare tra gli enzimi ad attività elicasica e polimerasica del replisoma. Tipin umana ricombinante è stata purificata nel nostro laboratorio in cellule di Escherichia coli in forma solubile. È stato visto che questa proteina interagisce con Tim, purificata a sua volta da cellule di insetto infettate con un baculovirus ricombinante. Grazie ad esperimenti di co-immuno-precipitazione effettuati con le proteine purificate, abbiamo riscontrato che sia i singoli fattori che il complesso Tim/Tipin interagiscono direttamente con il complesso MCM2-7. Inoltre, al fine di identificare le subunità del complesso elicasico che direttamente interagiscono con Tipin o con Tim, sono stati effettuati esperimenti di immuno-precipitazione da estratti di cellule di insetto infettate con baculovirus che esprimevano GST-Tipin o FLAG-Tim e le singole subunità di MCM2-7. Nonostante i risultati indicassero delle chiare interazioni tra le proteine analizzate, Tim o Tipin non interferiscono con l’attività elicasica del sotto-complesso MCM4-6-7, valutata con un substrato di DNA circolare a singolo filamento a cui è appaiata una sonda di 17 nucleotidi. Invece, le proteine singolarmente sono in grado di influenzare positivamente l’attività delle DNA polimerasi replicative, in particolar modo di DNA polε la cui attività aumenta di 7 volte quando è in presenza di Tim ricombinante. Da analisi condotte in vitro, risulta che Tipin è fosforilata dal complesso ciclina A/CDK2, attivo durante la fase di sintesi della replicazione. I siti coinvolti in questa modificazione sono stati identificati. Estratti cellulari di HeLa S3 asincrone, super-esprimenti Tipin, sono stati immuno-precipitati: i risultati ottenuti indicano che forme della proteina fosforilata si ritrovano anche in vivo. Questi dati forniscono soltanto un’informazione sulla modificazione a cui la proteina è sottoposta nelle cellule, senza però, poterla attribuire a nessun complesso enzimatico o stadio cellulare.

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