Citarella, Giuseppe (2011) PROGETTAZIONE ANALISI STRUTTURALE E IMPLICAZIONI FARMACOLOGICHE DI COMPLESSI A QUADRUPLA ELICA DEL DNA. [Tesi di dottorato] (Unpublished)

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Le quadruplex sono inusuali strutture secondarie del DNA, adottate da sequenze ricche di guanine, la cui importanza biologica dipende dalla loro presenza in diverse regioni del genoma umano, come le regioni promotrici di diversi geni, i centromeri e i telomeri. L'integrità del genoma è fondamentale per la sopravvivenza cellulare; infatti, il DNA può andare incontro a diversi tipi di danni che possono compromettere l'integrità della doppia elica; uno dei più frequenti è la depurinazione. Pertanto, uno dei progetti a cui ho lavorato durante il mio triennio di dottorato di ricerca, è stato quello di valutare l'effetto dell'introduzione di siti abasici in strutture quadruplex. Per i nostri studi abbiamo sintetizzato cinque oligonucleotidi(ODN), basati sulla sequenza 5’-TGGGGGT-3’, in cui abbiamo sostituito, uno per ogni posizioni un d-Spacer, analogo di sintesi del sito abasico. Per i nostri studi abbiamo utilizzato tecniche di spettroscopiche NMR e CD. Dai dati ottenuti è emerso che la presenza del d-Spacer non ostacola formazione di stabili strutture quadruplex, ma a seconda della posizione in cui è localizzato all'interno della sequenza può influire sia sulla flessibilità, che sulle proprietà cinetiche e termodinamiche dei complessi. Inoltre le G-quadruplex rappresentano il motivo strutturale predominante di diversi aptameri, oligodeossiribonucleotidi sintetici ottenuti mediante la tecnologia SELEX, dotati di notevole affinità e selettività per determinate molecole target e pertanto ritenuti potenziali agenti terapeutici molto promettenti. Il motivo base di queste strutture è la tetrade di G, un'organizzazione planare di quattro guanine in cui ogni residuo dona e riceve legame idrogeno da quello adiacente. Nel corso dei due successivi anni di dottorato di ricerca mi sono occupato della progettazione e sintesi del nucleoside modificato 8-metil-2’deossiguanosina(M) da inserire in opportune sequenze oligonucleotidiche, sottoposte poi a studi strutturali con l’impiego di tecniche spettroscopiche (Risonanza magnetica nucleare mono e bidimensionale, dicroismo circolare), allo scopo di valutare l’effetto di tali modifiche sulla stabilizzazione delle strutture quadruplex. La posizione 8 delle guanosine è particolarmente favorevole per tale modifica dato che si affaccia nel solco della quadruplex e non dovrebbe interferire con le proprietà strutturali del complesso, inoltre favorisce lo spostamento dell'equilibro della G da anti a syn. La sostituzione di una base naturale con una base modificata mira al miglioramento delle potenzialità di applicazione di oligonucleotidi sintetici come farmaci antivirali e antitumorali, fornendo modelli per la progettazione di nuovi inibitori della trombina, dell’integrasi del virus HIV-1 e della telomerasi, capaci di legarsi e stabilizzare strutture G-quadruplex. Per cui, sulla base delle considerazioni fatte, abbiamo sintetizzato una serie di oligonucletidi, analoghi delle sequenze naturali 5’-TGGGT-3’ e 5’-TGGGGT-3’, in cui abbiamo sostituito, in tutte le combinazioni possibili, un residuo canonico di G, con uno di 8-metil-2'-deossiguanosina. Gli effetti di tale sostituazione sono diversi a seconda della posizione nella sequenza coinvolta, in particolare, la presenza di un residuo modificato all'estremità 5' del run di G incrementa la stabilità termica e la velocità di formazione dei complessi tetramolecolari, dando luogo ad inusuali tetradi in conformazione glicosidica all-syn, Successivamente, allo scopo di approfondire la correlazione tra orientamento relativo dei filamenti, conformazione glicosidica delle guanosine, stabilità termica e posizione modificata nella sequenza, sulla base dei risultati ottenuti dal progetto precedente, nelle stesse sequenze naturali di riferimento, sono stati introdotti due residui di 8-metil-2’deossiguanosina in tutte le combinazioni possibili. In tutti i casi, la presenza di tali residui non ostacola la formazione di stabili strutture quadruplex tetramolecolari. in particolare, variano la posizione del residuo modificato lungo la sequenza si è tentato di orientare i filamenti in maniera inusuale, rispetto alla quadruplex di riferimento; i risultati più interessanti sono stati ottenuti per la sequenza 5'-TMGMGT-3', in grado di dar luogo ad una struttura quadruplex tetramolecolare antiparallela mai osservata prima d'ora. Se modifiche delle basi possono aumentare la selettività degli aptameri fornendo ulteriori contatti con la molecola target, modifiche del backbone zucchero-fosfato possono aumentare la loro resistenza all’attacco delle nucleasi. A tale scopo abbiamo pensato di sostituire i classici nucleotidi naturali appartenenti alla serie D con L-nucleotidi nella sequenza formante quadruplex ampiamente studiata 5’-TGGGGT-3’. Sono stati sintetizzati in totale dieci oligonucleotidi, otto dei quali eterochirali ossia contenenti sia D-nucleotidi che L-nucleotidi. Tali sequenze sono state sottoposte a studi strutturali mediante l'utilizzo delle tecniche spettroscopiche sopracitate. I risultati suggeriscono che gli ODN eterochirali sono capaci di formare stabili strutture quadruplex sia destrorse che sinistrorse a seconda del rapporto D/L e dalla posizione di tali residui. In particolare è emerso che l'estremità 3' e la parte centrale del run di G giocano un ruolo fondamentale nel determinare il senso di avvolgimento della quadruplex. Infatti, l'ODN L34, di sequenza 5’-TDGDGLGLGDTD-3', a bassa temperatura forma una quadruplex sinistrorsa ben definita nonostante sia composta principalmente da residui di tipo D. Questa struttura è caratterizzata dalla presenza di tre tetradi all-anti e una all-syn

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