Iannone, Carla (2013) Studio delle interazioni proteine-acidi nucleici mediante approcci di proteomica funzionale. [Tesi di dottorato]

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Le interazioni acidi nucleici-proteina sono basilari non solo per definire la funzione biologica di specifiche proteine ma anche per comprendre la loro influenza sulla regolazione dell’espressione genica. Il lavoro svolto durante il progetto di tesi è stato, dunque, incentrato sullo sviluppo di metodologie innovative in proteomica funzionale per lo studio delle interazioni proteine-acidi nucleici. A tale scopo le metodologie classiche per lo studio di tali interazioni (EMSA, ChIP, ecc…) sono state opportunamente modificate per avere informazioni sulla natura delle proteine presenti nei complessi multiproteici in grado di legare specificamente una sequenza di DNA o RNA. Il lavoro si è articolato come segue:  Messa a punto di una strategia EMSA/MS-MS L’attenzione si è focalizzata sul promotore del gene cftr in quanto, in seguito all’analisi di quest’ultimo in vari pazienti affetti da Fibrosi Cistica, è emerso che alcune regioni del promotore presentavano mutazioni correlate alla patologia. Sono pertanto state analizzate sia le regioni del promotore nella forma wild-type che in quella mutata. Per identificare le proteine che interagivano con le regioni geniche di interesse è stato messo a punto un saggio EMSA che consentisse di identificare le proteine legate alla sonda ritardata non più attraverso l’impiego di anticorpi mirati, quanto piuttosto attraverso tecniche di proteomica che portassero all’identificazione dell’intero complesso legato al DNA e non solo della specifica proteina.  Messa a punto di una strategia ChIP/MS-MS Il classico protocollo ChIP è stato modificato al fine di avere non solo informazioni circa le specifiche sequenze oligonucleotidiche a cui si lega la proteina di interesse, ma di identificare i componenti proteici presenti nel complesso proteine-DNA immunoprecipitato, mediante l’impiego di metodologie di spettrometria di massa tandem accoppiate a cromatografia capillare a fase inversa (nano-LCMSMS). Questo nuovo approccio sperimentale è stato impiegato nello studio del fattore trascrizionale Cbx 7 (Chromobox protein homolog 7). E’ stato dimostrato che il gene cbx7 è drasticamente down-regolato in carcinoma tiroideo ed altri tumori gravi. Inoltre, il livello d’espressione di Cbx7 in tumori tiroidei risulta inversamente relazionato con il grado di malignità della neoplasia.  Messa a punto di una strategia di RNA Chromatography Affinity Lo scopo di questo lavoro è stato quello di identificare le eventuali proteine che legano il 3’UTR di PC-1 (meglio conosciuta come ENPP1), proteina che causa resistenza all’insulina, contribuendo alla modulazione del suo mRNA, e che potrebbero quindi essere la causa della sua over-espressione e del suo ruolo nell’insulino-resistenza e nelle complicanze correlate. Come approccio sperimentale si è ricorso all’utilizzo della Cromatografia di affinità utilizzando non una sonda di DNA, come prevede la metodologia classica, ma utilizzando una sequenza di RNA. Il compito più impegnativo in questo tipo di esperimenti è stato quello di mettere a punto delle procedure opportune, sia in vivo che in vitro, che ci consentissero di isolare ed identificare i complessi proteici interagenti con geni implicati in diverse patologie.

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