Pezzotti, Maria Rosa (2013) Ci-Onecut genetic pathway:functional studies. [Tesi di dottorato]

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Abstract

I geni Rx (Retinal Homeobox) posseggono un pattern di espressione ed una funzione molto conservate nello sviluppo del Sistema Nervoso Centrale (SNC) anteriore e nei vertebrati è noto il loro ruolo nel processo di specificazione delle cellule della retina e/o nella loro proliferazione. Nell’invertebrato cordato basale Ciona intestinalis questo gene ha un ruolo fondamentale nella formazione dell’organo di senso della visione (l’ ocello) e nel differenziamento dei fotorecettori (D’Aniello et al., 2006). Sulla regione regolativa del gene Ci-Rx, composta da due frammenti minimi in grado di dirigere l’espressione del gene reporter negli stessi territori in cui è espresso il trascritto endogeno, si erano identificati due siti di legame per il fattore di trascrizione Ci-Onecut (OC), espresso, a partire dallo stadio di neurula fino allo stadio larvale, nella vescicola sensoria, nel ganglio viscerale e in alcune cellule del cordone nervoso caudale (D’Aniello et al., 2011). Nella mia attività di ricerca, mi sono occupata dello studio della cascata genica del fattore trascrizionale Ci-Onecut nella regolazione di Ci-Rx. Lo studio si è suddiviso in due fasi parallele: lo studio della relazione funzionale tra Ci-Onecut e Ci-Rx e la caratterizzazione del promotore di Ci-Onecut, allo scopo di trovare i fattori di trascrizione a monte del gene, in grado di regolarne l’espressione tessuto specifica. Per lo studio funzionale ho messo a punto esperimenti di perturbazione promotore guidata e saggi immunoistochimici, dai quali è emerso che come il gene Ci-Rx, anche Ci-Onecut potrebbe essere coinvolto nella regolazione dei geni coinvolti nella specificazione delle cellule pigmentate, e più in particolare della cellula che compone l’ocello. Per poter dimostrare una diretta connessione funzionale tra questi due geni ho quindi effettuato esperimenti di ibridazione in situ usando una sonda ad RNA complementare alla sequenza del gene Ci-Rx, per verificare, nelle larve in cui la proteina Ci-Onecut era stata perturbata, l’abilità di Ci-Onecut di influenzare l’espressione del gene Ci-Rx endogeno. Dagli esperimenti si è evinto che l’espressione genica di Ci-Rx dipende da quella della proteina Ci-Onecut e che Ci-Onecut agisce come attivatore trascrizionale, essendo esso necessario per l’espressione di Ci-Rx nella vescicola sensoria (D’Aniello et al., 2011). Per lo studio della regione promotrice del gene Ci-Onecut ho effettuato un’analisi per delezione di una regione intergenica di circa 3 kb, che separa Ci-Onecut dal gene che lo precede al 5’. I vari frammenti parzialmente sovrapposti, ottenuti per PCR, sono stati clonati a monte del gene reporter, ed elettroporati in uova fecondate di Ciona intestinalis. L’analisi mi ha portato all’isolamento di un frammento minimo di 262 bp in grado di ricapitolare l’espressione del gene reporter nei territori endogeni di Ci-Onecut. Tale frammento è stato poi sottoposto ad un’analisi in silico, dalla quale sono emersi Ci-Onecut e Ci-Neurogenina (Ngn) come putativi fattori di trascrizione in grado di riconoscere il frammento minimo del promotore e quindi di regolare l’espressione genica di Ci-Onecut. Dopo averne dimostrato la parziale co-localizzazione genica, per dimostrare la diretta interazione in vivo tra i fattori OC e Ngn coi loro specifici siti di legame, ho messo a punto esperimenti di iper-espressione ectopica ed esperimenti di perturbazione promotore guidata, che hanno dimostrato che le proteine OC e Ngn sono in grado di riconoscere i propri siti di legame sul frammento minimo di promotore e sono in grado di attivarli specificamente. L’analisi del meccanismo regolativo è stata effettuata mediante la mutagenesi sito-diretta. Dai dati riportati si è dimostrato un meccanismo regolativo secondo cui la Ngn agisce da fattore necessario e sufficiente all’attivazione di Ci-Onecut nei suoi territori endogeni e OC come fattore necessario al suo mantenimento; una volta tradotta, infatti, la proteina OC è in grado di autoregolarsi, innescando un meccanismo di feedback positivo attraverso il quale riconosce i suoi siti di legame contenuti sul suo promotore minimo e mantiene la sua espressione tessuto-specifica.

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