Di Lelio, Ilaria (2013) Uso di RNAi per il controllo degli insetti. [Tesi di dottorato]

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Tipologia del documento:	Tesi di dottorato
Lingua:	Italiano
Titolo:	Uso di RNAi per il controllo degli insetti
Autori:	Autore Email Di Lelio, Ilaria ilaria.dilelio@unina.it
Data:	2013
Numero di pagine:	176
Istituzione:	Università degli Studi di Napoli Federico II
Dipartimento:	Agraria
Scuola di dottorato:	Biotecnologie
Dottorato:	Insect science and biotechnology
Ciclo di dottorato:	25
Coordinatore del Corso di dottorato:	nome email Pennacchio, Francesco f.pennacchio@unina.it
Tutor:	nome email Pennacchio, Francesco f.pennacchio@unina.it
Data:	2013
Numero di pagine:	176
Parole chiave:	Parassitoidi, dsRNA
Settori scientifico-disciplinari del MIUR:	Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/11 - Entomologia generale e applicata
Depositato il:	05 Apr 2013 14:10
Ultima modifica:	15 Lug 2015 01:00
URI:	http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/9527

Abstract

La presente tesi di dottorato contribuisce allo sviluppo di nuove strategie di controllo degli insetti basate sull'utilizzo di RNA interference (RNAi) per silenziare geni che giocano un ruolo importante nella omeostasi fisiologica e nella riproduzione. Una delle questioni più importanti per l'uso dell’RNAi è la selezione di geni bersaglio il cui silenziamento, idealmente, dovrebbe generare fenotipi letali e mostrare limitati effetti off-target. In questo lavoro abbiamo affrontato questo problema selezionando geni che sono il target di strategie di virulenza adottate dagli imenotteri parassitoidi per sottomettere i propri ospiti, cercando di imitare i meccanismi generati dalla lunga co-evoluzione di queste associazioni antagonistiche. La prima parte del mio lavoro di dottorato è stata dedicata all'analisi funzionale di una proteina codificata da un gene (102) della larva di Heliothis virescens (F.). Questo gene è stato ritenuto un buon candidato per le strategie di silenziamento, in quanto i dati già disponibili, ottenuti nei nostri laboratori, sembrano indicare la sua sotto-regolazione in larve parassitizzate dal braconide endofago Toxoneuron nigriceps (Viereck), attraverso un meccanismo mediato da un RNA non codificante (rc5'ntTnBV) complementare al 5'UTR. Esperimenti condotti in vitro e in vivo hanno dimostrato che il gene 102 ha un ruolo chiave nella risposta immunitaria dell’insetto, infatti esso risulta coinvolto nella localizzazione del processo di melanizzazione della capsula emocitaria intorno agli oggetti estranei ed è essenziale per la formazione della capsula stessa. Questo processo è mediato dalla produzione di fibre amiloidi, a partire da frammenti della P102, che sono raccolte in grandi cisterne del reticolo endoplasmatico rugoso di granulociti e sferulociti. A seguito di stimolo immunitario, le fibre amiloidi sono rilasciate sulla superficie del corpo estraneo, dove formano uno strato che funge da impalcatura molecolare, che promuove la sintesi localizzata della melanina e l’incapsulamento. Questi risultati dimostrano, per la prima volta, che le fibre amiloidi hanno un ruolo funzionale chiave nell'immunità degli insetti, e sono stati già pubblicati in un lavoro frutto della collaborazione tra gruppi di lavoro appartenenti a diversi laboratori (Falabella et al., 2012). Per dimostrare che il trascritto non codificante rc5'ntTnBV è in grado, potenzialmente, di sopprimere attivamente la risposta immunitaria di H. virescens silenziando l'espressione genica 102 attraverso un meccanismo RNAi, abbiamo trattato le larve del nottuide con dsRNA diretto contro questo gene. Microiniezione orali di dsRNA102 in larve mature di H. virescens (ma non iniezioni emoceliche) hanno inibito l'incapsulamento delle sferette (beads) cromatografiche iniettate, provocando, in seguito a stimolo immunitario, la melanizzazione sistemica e quindi la morte. La Real Time PCR quantitativa (qRT-PCR) ha dimostrato che questo fenotipo immunodepresso è associato ad una significativa sotto-regolazione trascrizionale del gene 102. Questi cambiamenti sono perfettamente in linea con i dati funzionali raccolti per la P102, e indicano che il silenziamento di questo gene ha un forte impatto sulla risposta immunitaria di H. virescens. Il fatto che sequenze nucleotidiche correlate al gene 102 siano presenti in diverse specie di insetti, suggerisce l’esistenza di geni omologhi dal punto di vista funzionale. L’analisi delle librerie ESTs disponibili nei database pubblici ha permesso l'identificazione dell’omologo 102 in Spodoptera littoralis (Boisduval) (102Sl). Il ruolo di questo gene nella risposta immunitaria è stato valutato utilizzando il silenziamento mediato da RNAi. Microiniezioni orali di dsRNA 102Sl nelle larve ospiti mature hanno causato una notevole inibizione dell’incapsulamento delle beads, promuovendone solo una limitata melanizzazione superficiale. Tuttavia, diversamente da quanto osservato nelle larve di H. virescens, non si è verificata la melanizzazione sistemica, e larve trattate sono sopravvissute regolarmente. Il fenotipo immunosoppresso è associato a livelli significativi di silenziamento del gene 102Sl, confermandone il ruolo immunitario osservato anche per H. virescens. In realtà, la melanogenesi e la deposizione localizzata della melanina nelle due specie di lepidottero prese in considerazione appaiono controllate da meccanismi diversi. La comprensione di questo fenomeno richiede, pertanto, ulteriori studi. Queste osservazioni hanno stimolato l'idea di perseguire strategie per il controllo di S. littoralis, basato sul silenziamento del gene 102Sl mediato da RNAi. Inoltre, questo gene, così come il gene 102, è anche presumibilmente coinvolto nella formazione delle membrane basali degli epiteli da parte degli emociti (Falabella et al., 2012 e riferimenti ivi citati), e quindi l'interruzione della sua espressione potrebbe potenzialmente influenzare sia l'immunità, sia lo sviluppo dell’insetto. Per verificare questa ipotesi, abbiamo prima silenziato il gene 102 in uova di S. littoralis, per vedere se lo sviluppo embrionale fosse, in qualche modo, influenzato. Il silenziamento è stato eseguito mediante l’immersione delle uova in una soluzione contenente dsRNA102Sl, e questo ha portato ad un significativo aumento della mortalità delle uova e delle larve neonate, associato ad una sotto-regolazione trascrizionale del gene bersaglio. Per poter sfruttare la compromissione della funzione immunitaria indotta dal silenziamento del gene 102Sl, abbiamo valutato il possibile effetto del trattamento con dsRNA102Sl sull'attività insetticida di Bacillus thuringiensis. È stato dimostrato che l’immunosoppressione innescata da questo trattamento ha significativamente migliorato il tasso di mortalità di stadi di S. littoralis , come le larve mature, che sono poco sensibili all'esposizione di Bt. Questo esperimento fornisce la prova pratica che l'approccio proposto, basato sull’RNAi, può migliorare l’attività degli agenti di controllo biologico. Collettivamente, questi dati sperimentali indicano che il gene 102 è un bersaglio promettente per tecnologie di controllo di insetti dannosi basate sull’RNAi.

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