Ricciardi, Alessandro (2014) Valutazione di metodiche innovative nel controllo sostenibile di Tuta absoluta ( Meyrick)( Lepidoptera: Gelechiidae). [Tesi di dottorato]

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Item Type: Tesi di dottorato
Resource language: Italiano
Title: Valutazione di metodiche innovative nel controllo sostenibile di Tuta absoluta ( Meyrick)( Lepidoptera: Gelechiidae)
Creators:
CreatorsEmail
Ricciardi, Alessandroalexrcc@hotmail.it
Date: 25 March 2014
Number of Pages: 221
Institution: Università degli Studi di Napoli Federico II
Department: Agraria
Scuola di dottorato: Scienze agrarie e agro-alimentari
Dottorato: Agrobiologia e agrochimica
Ciclo di dottorato: 26
Coordinatore del Corso di dottorato:
nomeemail
Carputo, Domenicodomenico.carputo@unina.it
Tutor:
nomeemail
Garonna, Antonio PietroUNSPECIFIED
Date: 25 March 2014
Number of Pages: 221
Keywords: Tuta absoluta, pomodoro, linee tolleranti e/o resistenti, gene ortologo 102, RNA interference
Settori scientifico-disciplinari del MIUR: Area 07 - Scienze agrarie e veterinarie > AGR/11 - Entomologia generale e applicata
Date Deposited: 08 Apr 2014 08:58
Last Modified: 15 Jul 2015 01:01
URI: http://www.fedoa.unina.it/id/eprint/9666

Collection description

L’estrema dannosità di Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae) ha portato, a seguito della sua rapida e incontrollata diffusione in Europa, ad un suo indiscriminato incremento nell’uso di insetticidi, determinando le condizioni per un possibile sviluppo di popolazioni resistenti del fillominatore. Nonostante negli anni le contromisure abbiano raggiunto livelli di efficacia più che accettabili, il lepidottero rimane uno dei fattori chiave della coltivazione del pomodoro, anche perché gli approcci integrati di lotta non risultano pienamente validi per la difesa delle solanacee in pieno campo. Cattura massale, tecnica del disorientamento, nuove e più efficaci molecole insetticide, applicazioni di lotta biologica sono alcuni dei metodi con cui si può affrontare la lotta al fillominatore per contenere la sua dannosità. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di indagare su possibili alternative di controllo, da associare alle misure già descritte, tra cui: A) l’ applicazione di biotecnologie innovative come il silenziamento genico post-trascrizionale mediato da dsRNA (RNA interference). Il target considerato (gene 102), risulta molto conservato nei lepidotteri, ed è responsabile di esiziali processi fisiologici associati alla fitness dell’insetto come la modulazione della risposta immunitaria (Falabella et al., 2012). Allo scopo è stata valutata l’opportunità di isolare l’ortologo 102 anche in T. absoluta, al fine di procedere alla sua caratterizzazione strutturale mediante tecnica RACE e ad esperimenti funzionali di interferenza gene-specifica; B) la valutazione di fonti di tolleranza/resistenza presenti in germoplasma e linee commerciali di pomodoro. A) Si è proceduto ad isolare la sequenza più conservata del gene 102 utilizzando oligo specifici Spod FE-Spod RE disegnati sulla sequenza più conservata del cDNA 102 completo di Spodoptera littoralis che hanno fornito prodotti PCR della stessa lunghezza di quella amplificata nel nottuide, pari a 580 bp, e successivamente è stato preparato il costrutto (dsRNA 102) per poter procedere all’interferenza gene-specifica. Negli esperimenti di RACE 3’ utilizzando oligo specifici GSP RACE 3’, GSP nested e oligo universale AUAP sono state ottenute bande della lunghezza stimata mediante confronto con il cDNA 102 completo di S. littoralis e pari a 500 bp mentre nelle prove di RACE 5’ sono state ottenute bande di 180 bp endogene alla sequenza isolata e non corrispondenti alla lunghezza attesa. È stata valutata la necessità di eseguire prove di interferenza su uova in quanto, in lavori precedenti ( Di Lelio, 2013), trattamenti di soluzioni stabilizzate di dsRNA 102 su ovature di S. littoralis hanno determinato una significativa riduzione della percentuale di schiusa delle medesime nonché una ridotta sopravvivenza di larve derivante da uova interferite. In questi biosaggi le uova di T. absoluta sono state trattate con tre diverse concentrazioni della dsRNA 102 solution ( 2000 ng/u, 200 ng/u e 20 ng/u) e i pretrattamenti decorionanti con Chlorox al 5% sono stati effettuati al fine di facilitare l’internalizzazione della soluzione negli embrioni; nei controlli sono state utilizzate soluzioni di dsRNA GFP (200 ng/u). Non è stata osservata nessuna differenza significativa nella percentuale di schiusa delle uova tra tesi trattato e controllo e l’effetto del pretrattamento decorionante con candeggina non ha inibito significativamente la schiusa rispetto al trattamento eseguito con la sola dsRNA 102 solution. B) Per evidenziare aspetti legati a resistenza e/o tolleranza di linee commerciali di pomodoro al lepidottero sono stati effettuati biosaggi in serra, campo e camera climatica. Nei biosaggi di suscettibilità condotti in pieno campo e serra su 8 linee commerciali di pomodoro è stato osservato che alcune linee a bacca tonda ( Biliardino alto, Biliardino nano e Cerasella) presentavano i valori di infestazione più bassi sia per la percentuale di foglioline minate che per la percentuale di bacche infestate. Le indagini in camera climatica sono stati effettuati al fine di evidenziare e confermare la presunta bassa suscettibilità delle linee a bacca tonda riscontrata nei biosaggi precedenti. Per i fattori biotrofici riguardanti il numero di uova deposte, la percentuale di foglioline minate, la percentuale di bacche minate , la superficie fogliare minata e la tipizzazione di mine osservate su fusti, foglie e bacche la linea Biliardino nano è risultata essere la meno suscettibile tra tutte quelle saggiate; i risultati osservati per i fattori biometrici ( evoluzione biofenologica, saggi ponderali su larve e crisalidi) e per il potenziale biotico (fecondità femmine) attestavano le stesse evidenze osservate per le valutazioni biotrofiche. I risultati sperimentali di questo lavoro di tesi evidenziano dunque la necessità di ottimizzare ulteriormente il targeting del 102 mediante una completa caratterizzazione strutturale per ottenere effetti di interferenza gene-specifica mirati. Inoltre non è stato possibile valutare la modulazione melanogenetica codificata dal gene 102 in questa specie di lepidottero per la difficoltà di manipolare e iniettare le larve con microsferette necessarie per indurre la risposta immunitaria in saggi di incapsulamento in vivo. In riferimento ai risultati ottenuti dai biosaggi di interferenza su uova, sono inoltre necessarie ulteriori indagini sul ruolo svolto dal gene 102 nello sviluppo embrionale di T. absoluta. Risultati di precedenti ricerche ( Falabella et al., 2012) hanno suggerito che tale target è presumibilmente coinvolto nella neogenesi di epiteli basali in quanto regola la biosintesi di precursori chinonici fondamentali per la deposizione di scleroproteine responsabili della durezza e stabilità fisico-meccanica del tegumento durante le mute e lo sviluppo embrionale. La bassa suscettibilità della linea Biliardino nano emersa nei biosaggi ha fornito un risultato funzionale che può essere utilizzato per inserire suddetta linea in futuri programmi di selezione per putative linee resistenti e/o tolleranti. Tale evidenza è attualmente oggetto di approfondimento e di studio in analisi trascrittomiche tipo RNA-seq finalizzate ad individuare eventuali geni candidati responsabili della bassa suscettibilità di suddetta linea al lepidottero fillominatore.

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