Cristiano, Daniela (2024) Sviluppo di metodi rapidi per la ricerca di batteri patogeni negli alimenti. [Tesi di dottorato]

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Abstract

Nel corso del tempo il concetto di sicurezza alimentare è andato via via cambiando; infatti, è stato necessario sviluppare delle norme a tutela del consumatore, con lo scopo di controllare un alimento in tutte le fasi di produzione. Tutto ciò non è stato semplice e ancora oggi non lo è, perché l’argomento in questione risulta molto complesso ed in continua evoluzione. La prima svolta dal punto di vista normativo, metodologico e di tutela penale in materia di sicurezza alimentare, è avvenuta con l’emanazione della Legge 30 aprile 1962, n. 283 “Disciplina igienica della produzione e della vendita delle sostanze alimentari e delle bevande” e con la Legge 23 dicembre 1978, n. 833, che istituisce il Sistema Sanitario Nazionale (SSN). Ulteriori cambiamenti importanti di natura legislativa si sono avuti con l’entrata in vigore del Reg. (CE) n. 178/2002 dove: “stabilisce i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare, istituisce l'Autorità europea per la sicurezza alimentare e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare”; e con la traduzione normativa degli enunciati del Libro Bianco, riportati nei regolamenti che costituiscono il c.d. “Pacchetto Igiene”. Tutto questo ha portato ad una maggiore consapevolezza, di quanto fosse necessario avere più controlli nella produzione agro-alimentare, e quindi una maggiore qualità dei processi. A sostegno di questa esigenza una soluzione è stata l’introduzione nel mondo della produzione alimentare della certificazione dei processi, dei servizi e dei prodotti, da parte degli enti privati e/o pubblici, mediante applicazione delle norme “International Organization for Standardization” (ISO). La contaminazione dei cibi può avvenire in diversi modi, tutte le fasi di produzione, manipolazione e conservazione dei cibi, possono essere un rischio. Nel caso delle carni, ad esempio è fondamentale durante la macellazione, non intaccare il pacchetto intestinale, per evitare che il resto della carne destinata al consumo si contamini, così come per la produzione della frutta e verdura un fattore di contaminazione potrebbe essere l’acqua contaminata che viene impiegata per l’irrigazione o il lavaggio. Per non parlare dei rischi che ogni giorno ci sono negli ambienti casalinghi, per una cattiva gestione degli alimenti. Nonostante gli sforzi sostenuti dalle autorità sanitarie e dal mondo industriale, la contaminazione degli alimenti da parte dei microrganismi patogeni come Salmonella, Yersinia, Vibrio e tanti altri, è una eventualità che appare quasi inevitabile, e che può aver luogo in ogni fase della filiera di produzione. Questa criticità viene infatti confermata annualmente dai report pubblicato dall’EFSA. Da qui nasce l’esigenza di ricorrere a metodiche analitiche affidabili in grado di dare nei tempi più brevi possibili, informazioni sull’origine e la diffusione di tali patogeni, in modo da tutelare il consumatore e gestire nel migliore dei modi eventuali tossinfezioni alimentari. Sulla base di quanto detto lo scopo del lavoro di questa tesi è stato quello di sviluppare metodi più rapidi e sensibili, per la ricerca di alcuni patogeni come Yersinia enterocolitica, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus ed Salmonella spp. Per tanto nell’Articolo 1 è stata valutata la capacità del metodo SYBR Green Real Time PCR di rilevare i ceppi di Yersinia enterocolitica (4/O:3 e 1A/O:5). Sono stati analizzati 35 campioni totali, costituiti da carne suina prelevata dalla vendita al dettaglio, e da tamponi effettuati sulle carcasse di maiale ai macelli. Sui campioni analizzati per Y.enterocolitica, è stata valutata anche la flora microbica contaminante, cresciute su piastre di agar CIN e su Total Plate Count Agar (PCA) mediante MALDI TOF-MS. L'identificazione è avvenuta dopo, un primo arricchimento in brodi PSB o ITC e successiva semina sul terreno selettivo CIN. Per la ricerca di Yersinia enterocolitica (4/O:3, 1A/O:5) è stata utilizzata la SYBR Green Real time PCR. Un gran numero di specie batteriche (10 su CIN e 18 su PCA) è stato isolato dopo l'arricchimento in PSB, mentre dall’ITC sono stati recuperati 6 specie da CIN e 10 da PCA. Le Yersiniaceae erano la famiglia dominante nel primo giorno di incubazione, ma dal secondo giorno la percentuale di isolamento è diminuiti notevolmente. Le prove effettuate sui campioni sperimentalmente contaminati, hanno mostrato notevoli difficoltà, in quanto il biotipo 1A è stato sempre rilevato, a differenza del biotipo 4/O:3. Sulla base dei dati, l'arricchimento in PSB e ITC, attualmente proposti per il rilevamento di Yersinia enterocolitica, deve essere ulteriormente valutato e studiato per migliorare la capacità dei due terreni di isolare l’agente patogeno. Nell’Articolo 2 sono state utilizzate due piattaforme molecolari, la Real Time PCR e la Digital Droplet PCR (rtPCR e ddPCR), per valutare il comportamento della Yersinia enterocolitica in verdure a foglia verde contaminate sperimentalmente. Inoltre, è stata valutata la capacità del metodo di rilevare il patogeno dopo un'incubazione per undici giorni a differenti temperature. Confrontando i due metodi ci sono state differenze evidenti, tra i due approcci tecnici: solo la ddPCR ha rilevato il patogeno nei campioni con una concentrazione bassa di Y.enterocolitica. Inoltre, i risultati del presente lavoro hanno evidenziato, che sono di fondamentale importanza la durata e la temperatura di incubazione, per garantire la sopravvivenza e/o la crescita di Yersinia enterocolitica nei vegetali. Infatti è stato notato che, alle temperature comprese tra 18 e 25 °C la concentrazione dell'agente patogeno diminuisce notevolmente durante il tempo l'incubazione. I risultati relativi alla rtPCR, mostrano che il metodo tende a sottostimare la reale prevalenza della Y. enterocolitica nelle verdure, e che la temperatura e il tempo attualmente proposti per Y. enterocolitica (25 °C per 24 ore), consentono di ottimizzare il rilevamento. In conclusione, la ddPCR può essere senza dubbio proposta come una strategia alternativa molto affidabile per il rilevamento rapido dell'agente patogeno nei campioni alimentari. Nell’ Articolo 3 è stato valutato un metodo rapido basato sull'uso di una Real time PCR multiplex per rilevare V.parahaemolyticus, V. vulnificus e V. cholerae nei molluschi bivalvi. Trenta aliquote di molluschi bivalvi (Mytilus galloprovincialis) sono stati inoculati sperimentalmente con due livelli (basso ed alto) di V.parahaemolyticus, V. vulnificus e V. cholerae. I campioni sono stati analizzati parallelamente anche con il metodo di riferimento ISO 21872-1:2017. Il limite di rilevamento del metodo è stato del 50%, così distribuito 7,67 CFU/g per V. cholerae, 0,024 CFU/g per V. vulnificus e 1,36 CFU/g per V. parahaemolyticus. Il protocollo rtPCR per V. vulnificus e V. cholerae, è riuscito ad amplificare sia i campioni inoculati con il livello più basso, che quelli con il livello più alto. Il metodo molecolare, inoltre, ha mostrato un tasso di concordanza del 100% con il metodo microbiologico di riferimento. Il protocollo rtPCR per il V. parahaemolyticus, non è mai riuscito ad amplificare i campioni contaminato con il livello basso, ma ha invece amplificato 14 campioni (93,33%) con il livello alto. In conclusione, la Real time PCR multiplex sviluppata si è rivelata affidabile per V. vulnificus e V. cholerae, mentre per V. parahaemolyticus i risultati sono sicuramente promettenti, ma vanno effettuate ulteriori prove. Il metodo proposto potrebbe rappresentare uno strumento di monitoraggio rapido e, se utilizzato, consentirebbe una gestione del controllo ufficiale degli alimenti, sicuramente più veloce e sicuro. Nell’articolo 4 è stata sviluppata una strategia analitica rapida, basata sull'uso della Real-Time PCR per ricercare la Salmonella in diverse matrici alimentari. Sono stati utilizzati diversi approcci per rilevare rapidamente la Salmonella, da campioni di verdure in foglia, carne macinata, mozzarella e cozze contaminati sperimentalmente. I protocolli testati includevano due metodi di estrazione (bollitura e Chelex 100), due brodi di arricchimento (BPW e BPW integrati con RAPID'S Salmonella Capsule) e due temperature di incubazione (37°C e 42°C). I risultati ottenuti dal presente lavoro hanno dimostrato, che usando il brodo BPW preriscaldato per una notte a 41,5°C, ed utilizzando come metodo di estrazione quello con Chelex100, la Salmonella potrebbe essere rilevata già dopo quattro ore d’incubazione. Questo protocollo potrebbe rappresentare un metodo alternativo a quello di riferimento UNI EN ISO 6579-1:2020. L’applicazione di questa strategia analitica alternativa renderebbe tutto il processo più rapido, automatizzato e meno dispendioso, consentendo così, sia agli operatori del settore alimentare che le autorità competenti, di migliorare significativamente il controllo sui prodotti alimentari.

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