Lanotte, Luca (2013) Deformation and aggregation of red blood cells and vesicles flowing in microchannels. [Tesi di dottorato]

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Abstract

I globuli rossi (GR) rivestono un ruolo fondamentale nell'espletamento delle funzioni fisiologiche all'interno del corpo umano. Nel microcircolo, ad esempio, dove fluiscono in capillari dal diametro inferiore o, comunque, paragonabile alle loro stesse dimensioni, gli eritrociti sono responsabili dello scambio di ossigeno e sostanze nutritive tra il sangue ed i tessuti. Il rilascio di gas, secondo il parere pressocché unanime della comunità scientifica, si verifica grazie alla intima interazione tra i GR e l'endotelio che riveste i vasi sanguigni. E' stato, inoltre, provato in numerosi lavori scientifici come disfunzioni nelle proprietà dei globuli rossi e il danneggiamento del tessuto endoteliale, in particolare dello strato glicoproteico che lo ricopre (glycocalyx), siano la causa principale di malattie vascolari molto diffuse oggigiorno, come la trombosi, il diabete, l'aterosclerosi. Lo studio del comportamento dei globuli rossi nel sistema microvascolare ha assunto, dunque, un'importanza sempre maggiore nel mondo della ricerca. La conoscenza delle proprietà meccaniche e reologiche che consentono agli eritrociti di deformarsi e organizzarsi in aggregati all'interno dei vasi, per esempio, consentirebbe di comprendere a pieno i meccanismi che governano il flusso sanguigno e, di conseguenza, facilitare la diagnosi di stati patologici. In questo lavoro di tesi l'attenzione è focalizzata essenzialmente su due argomenti: l'aggregabilità dei globuli rossi durante il flusso in capillari e la funzione del glycocalyx endoteliale nel microcircolo. La formazione di treni di eritrociti all'interno di vasi di piccole dimensioni (diametro < 20 micron) è del tutto normale all'interno del corpo umano e favorisce la coagulazione del sangue in caso di danneggiamento dei tessuti. L'alterazione del normale fenomeno di aggregazione dei GR, però, può portare all'insorgere di patologie diffuse quanto dannose, come la trombosi. Per quanto l'argomento sia attuale e di rilevante interesse scientifico, un'analisi quantitativa del fenomeno di formazione di aggregati di globuli rossi (cluster) non è ancora stata effettuata. Nella prima fase di tale progetto di dottorato, dunque, presso il laboratorio Chemems del Dipartimento di Ingegneria Chimica, dei Materiali e della Produzione Industriale di Napoli, sono stati condotti esperimenti in vitro su sospensioni di eritrociti, con ematocrito attorno al 10%, per osservare la tendenza dei GR ad aggregarsi durante il moto in tubi in silica di diametro micrometrico (10 micron). E' stata verificata questa attitudine in funzione del battente di pressione imposto e del tempo di residenza all'interno di segmenti di microcapillari, misurando la lunghezza degli aggregati e la loro composizione in numero. La campagna sperimentale è stata mirata a comprendere quale sia il tipo di interazione che si verifica tra le cellule componenti un cluster: si tratta di un'interazione di tipo puramente idrodinamico o intervengono anche forze di altra natura? Dai risultati sperimentali appare chiaro come la vera forza spingente del fenomeno sia la pressione imposta nei microtubi. La visione più precisa del fenomeno, grazie ad un approccio microfluidico, consente di gettare le basi per la progettazione e la successiva messa a punto di dispositivi clinici atti a monitorare l'aggregabilità eritrocitaria a fini diagnostici, su sangue sano, ma anche in corrispondenza di stati infiammatori, ad esempio. La seconda parte del progetto è stata effettuata in collaborazione tra il Dipartimento di Ingegneria Chimica, dei Materiali e della Produzione Industriale di Napoli ed il Laboratoire Interdisciplinaire de Physique di Grenoble. E' stata effettuata una campagna sperimentale su microcapillari in vetro rivestiti da polymer brush, al fine di simulare le condizioni in vivo nel microcircolo. Si è verificato come la presenza di strati (layer) polimerici alteri non solo le proprietà idrodinamiche del flusso nei microtubi trattati, ma anche quelle dinamiche dei globuli rossi circolanti al loro interno. E' stabilito con certezza che il lumen dei vasi sanguigni è rivestito da uno strato di glicopolimeri (glycocalyx) legati alla membrana delle cellule endoteliali che ricoprono le loro pareti. La conoscenza del ruolo idrodinamico del layer in questione sarebbe molto utile per (i) comprendere come le disfunzioni o i danneggiamenti del glycocalyx siano coinvolti in patologie vascolari (ad esempio l'aterosclerosi) e (ii) al fine di sviluppare test basati sulla microfluidica, in grado di rappresentare correttamente le interazioni tra pareti e componenti del sangue. I polymer brush, per la loro spiccata attitudine a modificare le proprietà chimico-fisiche delle superfici ed alterare il flusso in ambito micro e nanofluidico, rappresentano una opzione logica, allo scopo di riprodurre l'effetto del glycocalyx all'interno dei vasi nel microcircolo e le interazioni tra catene polimeriche e globuli rossi. Layer nanometrici di polyhydroxyethylmethacrylate (pHEMA) sono stati prodotti attraverso cosiddetta tecnica grafting-from e, dopo accurata caratterizzazione, utilizzati per rivestire le superfici interne di capillari in vetro dal diametro di 10 micron. In questo lavoro, si presentano i profili di velocità ottenuti investigando il flusso all'interno dei suddetti microcapillari rivestiti. Si mostra come la riduzione del flusso, causata dalla presenza delle spazzole polimeriche, è significativamente più grande rispetto a quanto si verificherebbe in seguito a una semplice riduzione geometrica del lumen disponibile o se considerassimo lo strato polimerico come un bordo poroso ed elastico, così come suggerito in precedenti lavori teorici. Inoltre, dall'osservazione del flusso di eritrociti all'interno dei microcapillari rivestiti da polymer brush, si è riscontrato come, sia la velocità che la deformabilità dei GR, dipendano strettamente dalla presenza dei layer polimerici sulle pareti dei microtubi. Risulta anche evidente come il rallentamento riscontrato nel flusso dei globuli rossi non sia direttamente proporzionale allo spessore dei layer, al contrario di quanto verificato nelle misurazioni riguardanti il puro flusso idrodinamico. I promettenti risultati rappresentano un primo passo verso la realizzazione di un sistema artificiale dall'approccio "bio" e incoraggiano la prosecuzione e l'approfondimento della sperimentazione in vitro.

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