De Chiara, Francesco (2014) GENETIC RESISTANCE TO HUMAN PULMONARY TUBERCULOSIS: THE RESULT OF ALLELIC AND NON-ALLELIC INTERACTIONS. [Tesi di dottorato]

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Abstract

Summary La tubercolosi (TB) è una malattia di origine infettiva causata dal bacillo Mycobacterium tuberculosis (MTB), chiamato anche Bacillo di Koch. Essa figura al secondo posto nelle cause di morte per malattie infettive in tutto il mondo dopo lo Human Immunodeficiency Virus (HIV). Nel 1993, la TB è stata classificata come emergenza mondiale dalla World Health Organisation (WHO) che ha stimato circa 9 milioni di nuovi casi nel 2011 e 1.4 milioni di decessi dovuti alla TB in 84 Paesi. La stessa WHO considera l'Italia uno dei paesi occidentali in cui si sarebbe verificato, tra il 1988 ed il 1990, il maggior incremento del numero di casi di TB. Nonostante la disponibilità di trattamenti efficaci e poco costosi, la tubercolosi risulta più diffusa nella popolazione povera che tra quella ricca, sia nelle regioni industrializzate che nelle regioni in via di sviluppo. Le regioni nelle quali si riscontra il 60% dei casi totali di TB sono: Pakistan, sud dell’Africa, China e India. Il più alto tasso di incidenza della tubercolosi si riscontra nell’Africa Sub-Sahariana, soprattutto associata all’infezione da (HIV). Oltre all’infezione da HIV, l’incremento nel tasso di incidenza della tubercolosi è provocato dalla comparsa di ceppi resistenti alla maggior parte dei farmaci anti-TB. Altri fattori che incidono sulla diffusione della TB sono: l’aumento della popolazione; la difficoltà a rilevare i casi tra le masse povere; il ridotto tasso di cure in paesi in via di sviluppo; la trasmissione dell’infezione in ospedali e prigioni sovraffollati e l’immigrazione di individui da paesi dove la TB è endemica (WHO 2012). La principale fonte di contagio è rappresentata dalle persone affette da TB, anche se soltanto il 10% degli individui mostra i segni di tubercolosi attiva entro i 18 mesi dall’avvenuta infezione. Nei restanti casi, la risposta immunitaria conseguente all’infezione riesce ad arrestare la crescita del MTB. Ciò nonostante, il patogeno è completamente eradicato soltanto nel 10% dei casi mentre, nel restante 90%, il MTB riesce ad eludere i meccanismi antibatterici delle cellule del sistema immunitario restando in uno stato non-replicativo (dormiente o latente). Questo processo è chiamato Latent Tuberculosis Infection (LTI) e colpisce circa due miliardi di persone al mondo (Koul, Herget et al. 2004). Mycobacterium tuberculosis Il Mycobacterium tuberculosis è un membro della specie Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Ad esso appartengono altre 6 specie correlate geneticamente: M. bovis, M. africanum, M. microti, M. pinnipedii, M. caprae e M. capretti. Tutte possono provocare tubercolosi, ma hanno un diverso host range (Cole, Brosch et al. 1998). Il M. tuberculosis ha una struttura unica che lo rende diverso da tutti gli altri batteri. Partendo dall’interno verso l’esterno troviamo la membrana cellulare rivestita da diversi strati di peptidoglicano (PG), arabinogalattani (AG), lipomannani (LM), mannose-lipoarabinomannani (ManLAM) e acidi micolici (MA) legati covalentemente tra di loro a formare una struttura molto complessa. Il peptidoglicano costituisce lo scheletro di questa struttura. Esso è costituito da lunghe catene di N-acetilglucosammina (NAG) legate a catene di acido muramico (NAM) attraverso dei residui di L-alanyl-D-iso-glutaminyl-meso-diaminopimelic acid (DAP) (Velayati, Farnia et al. 2012). I polisaccaridi a lunga catena (LM, AG e LAM) formano un ponte tra il peptidoglicano e gli acidi micolici che sono acidi grassi a lunga catena che rappresentano i componenti principali della parete del micobatterio. Riconoscimento del Mycobacterium tuberculosis I Pathogen-associated molecular patterns (PAMP) del MTB vengono riconosciuti da specifici Pathogen recognition receptors (PRRs) posti sulla superficie delle cellule del sistema immunitario dell’ospite. Questi recettori, tra cui i Toll-like receptors (TLRs) sono essenziali per coordinare la risposte immunitaria innata dell’ospite (Jo 2008). L’interazione tra i PAMPs del MTB ed i TLRs innesca una cascata di trasduzione del segnale che culmina in una risposta pro-infiammatoria da parte delle sistema immunitario dell’ospite (Harding and Boom 2010). Tuttavia, il micobatterio ha sviluppato efficaci strategie atte a modulare o addirittura inibire tale risposta. I più importanti ligandi posti sulla superficie del micobatterio i quali interagiscono con i TLRs sono: 19 kDa lipoprotein, il lipomannano (LM) ed il mannose-lipoarabinomannano (Jo, Yang et al. 2007). L’interazione di questi ligandi con i TLRs porta all’attivazione del nuclear trascription factor B (NF-kB) e la conseguente produzione di citochine pro-infiammatorie come tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interferon-gamma (IFN-γ) e anche dell’ossido nitrico attraverso via myeloid differentiation primary response protein 88 (MyD88)-dipendenti che indipendenti (Yamamoto, Sato et al. 2003, Jo 2008). Uno studio ha mostrato che, almeno nel topo, il contatto prolungato con la 19 kDa del MTB da parte dei macrofagi alveolari attenua la processazione dell’antigene che a sua volta attenua l’espressione del major histocompatibility complex (MHC)-II smorzando così l’attivazione delle T cells (Fulton, Reba et al. 2004). In questo modo, una sottopopolazione di macrofagi infettati con la funzione dell’APC modulata, costituisce una nicchia invisibile al sistema immunitario dove il batterio può sopravvivere e resistere. Scopo della tesi Schurr (Schurr 2007) si è chiesto se la tubercolosi fosse una malattia infettiva o ereditaria. L’autore sapeva molto bene che la tubercolosi può essere contratta solo in presenza del patogeno. Con la sua domanda (posta come titolo all’articolo), Schurr ha inteso mettere in evidenza il ruolo essenziale della componente ereditaria ai fini della resistenza alla tubercolosi. Indi per cui la ricerca si è incentrata sull’associazione (punto I) e interazione (punto II) tra i geni MyD88 e TIRAP e la tubercolosi. Entrambi i geni funzionano come trasmettitori del segnale dai recettori esterni alla cellula fino all’interno del nucleo dove avviene la trascrizione di geni capaci di innescare la risposta immune, innata e adattativa. Inoltre, la loro posizione su cromosomi distinti (indipendenza) e la loro comune funzione (trasmissione del segnale) rende plausibile l’ipotesi che i geni interagissero. Anche quest’anticipazione si è dimostrata valida, offrendo un esempio di epistasi (interazione tra geni non alleli). Inoltre, la letteratura scientifica inerente al coinvolgimento di MyD88 e TIRAP nella tubercolosi presenta notevoli discrepanze, soprattutto nel delicato campo degli studi di associazione. Topi “knockout” per MyD88 mostrano una produzione di TNF-α, IL-12 e NO molto ridotta in risposta all’infezione dell’MTB e muoiono in 4 settimane (Fremond, Yeremeev et al. 2004). Topi “knockout” per TIRAP, invece, riescono a controllare efficacemente l’infezione da MTB (Fremond, Togbe et al. 2007). Il Single-nucleotide polymorphism (SNP) C558T di TIRAP è associato con la suscettibilità alla tubercolosi meningea (Hawn, Dunstan et al. 2006, Caws, Thwaites et al. 2008), e quello S180L conferisce protezione contro la malaria e la tubercolosi (Khor, Chapman et al. 2007). Studi successivi non hanno confermato il ruolo protettivo di S180L (Nejentsev, Thye et al. 2008, Miao, Li et al. 2011), TIRAP (rs352165 and rs352167) e MyD88 (rs4988457 and rs6767684) contro la tubercolosi (Khor, Chapman et al. 2007, Nejentsev, Thye et al. 2008). Alla luce di queste discrepanze emerse, perfino all’interno dello studio dello stesso SNP (rs81777374) in differenti etnie, si è deciso di investigare il ruolo di questi SNPs nei malati di tubercolosi polmonare nella popolazione italiana. In aggiunta, il M. tuberculosis ha l’abilità di passare dalla forma attiva a quella dormiente. Pertanto i geni MyD88 e TIRAP potrebbero influenzare diversamente le due forme d’infezione. In questo caso, l’eterogeneità dei pazienti (con infezione attiva e con infezione latente) può ridurre notevolmente il potere discriminante del test statistico (caso-controllo). Per investigare meglio questo punto dello studio, si è pensato di spostare la ricerca su di un altro modello: i bovini. Da questi animali è stato possibile ottenere biopsie polmonari al momento della macellazione. L’indagine ha chiarito che – come ipotizzato – il genotipo può influenzare l’infezione, in termini di interazione tra i geni e la il tipo di risposta attuato. Results Study design Per saggiare la riproducibilità dei risultati, è stato scelto uno studio a due fasi. Nella prima fase dello studio (hypotesis-generating) sono stati reclutati 100 casi e 100 controlli e genotipizzati per il sito polimorfico TIRAP rs8177374 e MyD88 rs6853. Entrambi i siti sono stati scelti perché sono stati gli unici tra i 5 saggiati per gene a mostrare una frequenza allelica >0.05. Inoltre entrambi i siti hanno mostrato associazione statisticamente significativa con la malattia (P-value <0.05). Sulla base dei risultati dello studio preliminare (MyD88: OR 0.40 e TIRAP: 0.48), è stato calcolato che - per assicurare allo studio una capacità discriminante del 96% con un livello di significatività dello 0.01- fosse necessario estendere lo studio ad un campione di 185 casi e 185 controlli (nel caso di MyD88) e 313 casi e 313 controlli (nel caso di TIRAP). Nella seconda parte dello studio sono stati coinvolti 400 casi e 400 controlli (indipendenti dai casi e dai controlli utilizzati nella fase preliminare dello studio). Per rendere la classe dei casi più omogenea possibile, sono stati reclutati solo pazienti con TB polmonare attiva confermata attraverso l’esame ai raggi X, il test batteriologico e la PCR. Tutti i casi sono stati trattati presso l’ospedale Monaldi (Napoli), il centro di referenza per la tubercolosi del Sud Italia. I controlli sono stati scelti tra mogli, mariti e conoscenti dei pazienti senza evidenze cliniche di tubercolosi (negativi al test con l’interferone gamma). In tal modo i controlli non sono correlati geneticamente ai casi e non risultano infettati, nonostante esposti al Mycobacterium tuberculosis (>2 anni). I criteri utilizzati per classificare casi e controlli sono stati gli stessi in entrambe le fasi dello studio. I casi ed i controlli sono stati collezionati durante più di 5 anni di collaborazione tra l’Ospedale ed il laboratorio della Prof.ssa Capparelli Rosanna. In questo tempo sei controlli sono diventati positivi al test con l’interferone e quindi sono stati esclusi dallo studio. I casi consistevano in 258 maschi e 142 femmine (media età 50±19 anni); i controlli in 222 maschi e 178 femmine (media età 49±17 anni). Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell’Ospedale Monaldi. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti che hanno partecipato alla ricerca. Eterozigosi è associata con la protezione contro la tubercolosi polmonare. Le frequenze genotipiche dei markers rs6853 e rs8177374 sono in equilibrio di Hardy-Weinberg tra i controlli, ma non tra i casi. Ad entrambi i loci, l’eterozigosi (AG per MyD88 o CT per TIRAP) è associata con la resistenza alla tubercolosi polmonare. L’età rappresenta un fattore di rischio per la tubercolosi polmonare. Per conoscere come il rischio legato all’età varia attraverso le stratificazioni, i dati sono stati analizzati utilizzando il modello della regressione logistica. L’analisi è stata ristretta ai gruppi con un numero ≥ di 45 individui. A parte la categoria 31-40 vs 21-30 anni (apparentemente protetta, OR 0.31), il modello ha mostrato che il rischio di sviluppare la malattia aumenta con l’età. Chiaramente, l’età e le possibili variabili associate all’età - come il fumo, il diabete e la prolungata esposizione al patogeno - possono neutralizzare la resistenza genetica. Il modello di regressione logistica è stato anche usato per dissezionare il contributo di ogni singolo genotipo e la loro interazione. Particolarmente evidente è l’interazione tra i genotipi AG e CT (OR 0.09) e l’interazione in direzione opposta tra i genotipi GG e TT, AA e CC, AA e CT (OR 5.78, 5.78 e 7.46, rispettivamente). L’eterozigosi controlla l’infiammazione Per investigare sul meccanismo di come l’ospite può controllare l’infezione secondo l’assetto genotipico, i linfociti di donatori sani (controlli) (nove gruppi genotipici; 5 campioni/gruppo) sono stati stimolati con il ceppo Mycobacterium tuberculosis H37Rv inattivato al calore e poi sono stati misurati i livelli di TNF-α, IFN-ɣ e NO (nitric oxide) rilasciati nel mezzo attraverso un’ELISA test. Nel contesto del genotipo AA, i soggetti CT mostrano livelli intermedi di TNF-α, IFN-ɣ e NO rispetto ai soggetti CC e TT. Nel contesto genotipico AG, i dati mostrano la stessa tendenza, sebbene alcune differenze non siano significative. Inoltre, sono stati osservati bassi livelli di citochine in soggetti GG, come se l’allele “A” favorisse la produzione di citochine e l’allele “G” la attenuasse. Questi dati indicano che gli eterozigoti sono associati con un livello intermedio di citochine and NO. Questi risultati suggeriscono che i due loci cooperano fortemente a controllare la malattia. Questa evidenza è fortemente supportata dall’evidenza che TIRAP e MyD88 formano eterodimeri. Analisi bioinformatica Il sito rs6853 risiede nella regione 3’ UTR del gene MyD88. Comparando le sequenze genomiche di diverse specie emerge che entrambi gli alleli A e G sono conservati in molte specie, suggerendo che essi sono mantenuti o almeno tollerati, dalla selezione naturale. Attraverso l’analisi con 4 ENCODE tracks è emerso che la regione 3’ UTR del sito polimorfico potrebbe influenzare l’interazione tra l’mRNA ed fattori proteici. Il sito rs8177374, che risiede sull’esone 5 del gene TIRAP, ha permesso di valutare se il cambiamento di una serina con una leucina in posizione 180 potesse influenzare la struttura della proteina. Entrambi gli amminoacidi sono rappresentati in posizione 180 dei geni TIRAP di 22 specie di mammiferi. E’ stato possibile predire che entrambi sono compatibili con l’attività della proteina. Questi risultati suggeriscono che le isoforme A e B sono originate dalla stessa molecola di mRNA che ha subito splicing alternativo conferendo una ulteriore plausibilità biologica al polimorfismo. Discussione e conclusioni Molto poco è conosciuto del “crosstalk” tra geni implicati nella resistenza ad un patogeno. In questo lavoro è stato investigato come i geni MyD88 e TIRAP si influenzano a vicenda. L’ipotesi che i due geni potrebbero interagire sembra plausibile in quanto entrambe le proteine MyD88 e TIRAP sono coinvolte nel “signaling” cellulare a valle dei TLRs. Sempre in questo studio è stato dimostrato che i due geni cooperano o si antagonizzano tra di loro sulla base della loro combinazione allelica. L’eterozigosi ad entrambi i loci fornisce una protezione più forte (P= 1.3x10-12, age-corrected) rispetto all’eterozigosi ad un solo locus (MyD88 P= 7.8x10-8; TIRAP P= 2x10-6). Allo stesso tempo, negli individui AG/TT (MyD88/TIRAP) il genotipo TT neutralizza la protezione apportata dal genotipo AG. Questi dati, seppur in maniera limitata, mostrano come due o più geni indipendenti possono concorrere alla formazione e regolazione dello stesso fenotipo. Gli individui eterozigoti ai loci MyD88 o TIRAP mostrano livelli intermedi di TNF-α, IFN-ɣ e NO rispetto alle altre classi genotipiche (Figure 1). TNF-α, IFN-ɣ e NO giocano un ruolo fondamentale contro Mycobacterium tuberculosis (Casanova and Abel 2002, Scanga, Bafica et al. 2004, Velez, Hulme et al. 2009). NO esercita una forte attività anti-micobatterica ed insieme a TNF-α, favorisce la formazione dei granulomi (Miller and Ernst 2009). IFN-ɣ induce la produzione di NO, l’espressione delle molecole MHC II e la presentazione dell’antigene (Fortune, Solache et al. 2004, Scanga, Bafica et al. 2004). Tuttavia, vi è anche l’evidenza che la sovra-espressione di queste molecole favorisce la tubercolosi. Molti dei sintomi sono proprio causati dalla risposta immune dell’ospite, piuttosto che dal Mycobacterium tuberculosis (Glickman and Jacobs 2001). Infatti, la riattivazione della TB si è osservata dopo il trattamento terapeutico con TNF-α (Mankia, Peters et al. 2011) o in pazienti affetti da HIV dopo trattamento antiretrovirale (French and Price 2001). Anche l’ipo-espressione di TNF-α, IFN-ɣ e NO favorisce la TB, quindi il vantaggio biologico di averne un livello intermedio di espressione diventa chiaro. Questo vantaggio risulta molto più marcato nei doppi eterozigoti che mostrano come il crosstalk tra i geni si estenda dal livello epidemiologico a quello molecolare. Il vantaggio espresso dagli eterozigoti suggerisce che le frequenze alleliche ai siti polimorfici di rs6853 e rs8177374 sono mantenuti dal bilanciamento del polimorfismo, dove l’omozigosi è associato con la tubercolosi polmonare e l’eterozigosi alla resistenza. In accordo con questa ipotesi vi è il fatto che entrambi i siti polimorfici sono conservati attraverso la speciazione. Inoltre il fatto che la combinazione allelica influisce sui livelli di TNF-α, IFN-ɣ e NO suggerisce che l’associazione sia tra MyD88 e TIRAP piuttosto che tra geni strettamente correlati a loro. In conclusione, l’associazione di rs8177374 con la TB polmonare probabilmente sarà confermata anche in studi futuri, mentre rs6853 risulta associato in questo studio, ma non in due lavori precedenti (Miao, Li et al. 2011, Sanchez, Lefebvre et al. 2012), quindi al momento resta uno studio esplorativo hypothesis-testing study. Commento Purtroppo gli studi di associazione mancano di riproducibilità (Ioannidis, Ntzani et al. 2001). Durante la prima fase dello studio siamo incappati in ostacoli più o meno appianabili. Per ridurre al minimo tutte le fonti di errore è stato fatto in modo che tutto lo studio fosse costruito intorno a precisi punti: replicazione dei risultati in maniera indipendente (studio a 2 fasi); bassi P-value (10-6-10-8); selezione di casi omogenei (lo studio ha arruolato pazienti con tubercolosi polmonare clinicamente diagnosticata e confermata con X-ray al torace, PCR e positività al test batteriologico); uso di appropriati controlli (individui senza segni evidenti della malattia, ma esposti al patogeno e geneticamente non correlati ai casi). Inoltre, l’evidenza che l’associazione è mantenuta in 3 differenti etnie rendono improbabile che l’associazione riscontrata tra i geni MyD88 e TIRAP e la TB sia un artefatto derivante dalla errata strutturazione demografica del campione esaminato. Ad ogni modo, la stessa associazione risulta dare risultati contrastanti quando si analizzano differenti popolazioni (Nejentsev, Thye et al. 2008, Miao, Li et al. 2011, Sanchez, Lefebvre et al. 2012). Quindi la riproducibilità di uno studio è necessariamente un artefatto? Noi pensiamo di no. Nel genoma umano nuovi alleli costantemente si presentano creando una vasta eterogeneità che si amplifica ulteriormente con l’interazione tra di essi e con l’ambiente. Tutta questa genetica eterogeneità è difficile da rilevare a priori e plausibilmente contribuisce all’irriproducibilità degli studi di associazione. Inoltre, durante tutta la sua lunga storia evolutiva, il Mycobacterium tuberculosis ha sviluppato un’efficace strategia per rendere difficile la sua eradicazione da parte del sistema immunitario dell’ospite: la latenza. Questo rappresenta un ulteriore grado di difficoltà nel costruire uno studio di associazione con la TB. Sulla base di queste considerazioni, il passo successivo è stato quello di disegnare uno studio caso-controllo scevro dai tutti i principali fattori di “bias” per quanto concerne il Mycobacterium tuberculosis. Il primo passo è stato cercare un modello che presentasse le seguenti caratteristiche: - Azzeramento o minimizzazione dei fattori ambientali; - Stessa etnia - Possibilità di epurare i controlli da eventuali soggetti con TB latente; - Un numero consistente di casi e controllo per un’adeguata potenza statistica). Il modello scelto è stato quello dei bovini per la possibilità di biopsie polmonari al punto della morte grazie all’attiva collaborazione tra il laboratorio della Prof.ssa Capparelli e l’Istituto Zooprofilattico del Mezzogiorno. In aggiunta, grazie alla collaborazione con la Dott.ssa Berisio del Dipartimento di Chimica dell’Università di Napoli è stato possibile mettere a punto un “in-house assay” capace di discriminare tra batteri attivi e quelli dormienti. Mycobacterium bovis e diagnosi di infezione polmonare L’agente patogeno che causa la tubercolosi nei bovini è il Mycobacterium bovis. Nei paesi dove i programmi per l’eradicazione della tubercolosi bovina sono operativi (test periodici agli animali di allevamento, ispezioni delle carni e pastorizzazioni del latte) hanno ridotto a meno dell’1% i casi di tubercolosi umana attribuibile al Mycobacterium bovis, circoscrivendola soltanto alle persone affette da HIV o alle persone che vantano una prolungata esposizione ad animali infetti (persone del settore e veterinari). Il Mycobacterium bovis ha un ampio range di ospiti, il quale include numerose specie di allevamento e selvatiche. Esso è patogeno per l’uomo, mentre il Mycobacterium tuberculosis non è patogenico nei bovini (Ocepek, Pate et al. 2005). Questa caratteristica potrebbe essere attribuibile alla sola differente espressione genica tra di loro (Neill, Skuce et al. 2005) in quanto studi genetici hanno dimostrato l’elevata similarità tra le due specie batteriche (circa 99.5% a livello nucleotidico) (Garnier, Eiglmeier et al. 2003). Tutte queste osservazioni prese insieme forniscono la plausibilità biologica del ruolo cruciale giocato dal gene MyD88 anche contro la tubercolosi bovina. Il gene TIRAP non è stato incluso nello studio perché la frequenza delle mutazioni risultava essere inferiore a 0.05. L’infezione della tubercolosi polmonare può essere di tipo attivo (ATI) o latente (LTI); quest’ultima è caratterizzata dalla presenza di batteri dormienti (vitali, ma che non crescono sui normali mezzi di crescita) (Oliver 2010). I metodi comunemente usati per diagnosticare la tubercolosi sono il tuberculin skin test (TST) o l’IFN-ɣ assay. Tuttavia, questi metodi non distinguono tra ospiti ancora infetti e quelli che hanno controllato con successo l’infezione (Barry, Boshoff et al. 2009). Presi insieme questi gruppi, almeno nel presente studio, avrebbero potuto ridurne sensibilmente la capacità discriminante (Schurr 2007). Results Diagnosi di casi e controlli Mycobacterium tuberculosis possiede 5 resuscitation-promoting genes (Rpf) che codificano per altrettante proteine (RpfA to RpfE), le quali in forma di proteine ricombinanti in Escherichia coli, inducono la risuscitazione del Mycobacterium tuberculosis (Biketov, Potapov et al. 2007) e Mycobacterium marinum in vivo ed ex vivo (Parikka, Hammaren et al. 2012). Sulla base di questi risultati, è stato sviluppato un “in-house assay” capace di resuscitare i micobatteri dormienti attraverso l’impiego della proteina RpfB. È stato possibile recuperare micobatteri dormienti dal latte e polmoni provenienti da 7 animali trattati con RpfB, mentre nessuna colonia di batteri si è avuta dagli stessi campioni non trattati con RpfB. I risultati tra latte e polmoni sono stati pienamente concordanti. Altri 20 campioni (latte e polmone) sono stati utilizzati per validare l’assay. Il test è stato successivamente esteso a tutti gli animali utilizzando campione di polmone collezionati post-mortem. Un test di PCR discriminante tra Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, o Mycobacterium avium, ha determinato che tutti i campioni analizzati (con ATI o LTI) erano infettati da Mycobacterium bovis. In conclusione, i casi con ATI sono stati trovati positivi alla PCR ed al test batteriologico in assenza di RpfB; i casi con LTI sono stati trovati positivi alla PCR ed al test batteriologico in presenza di RpfB; i controlli sono soggetti esposti al Mycobacterium bovis (perché provengono dagli stessi allevamenti dove sono stati prelevati i casi), ma negativi alla PCR ed al test batteriologico sia in presenza che in assenza di RpfB. Disegno sperimentale Anche in questo caso lo studio è stato composto da due fasi. La fase preliminare ha coinvolto solo 50 animali di controllo, i quali sono stati separatamente confrontati con 50 casi con ATI o 50 casi con LTI. La fase preliminare ha mostrato una significativa associazione del sito polimorfico MyD88 A625C con ATI (P=0.01), ma non con LTI (P=0.84). Il sito A625C è situato sull’introne 1 del gene MyD88. Questa fase preliminare dello studio ci ha fornito due punti importanti: primo, che l’associazione sembra essere abbastanza robusta (poiché è stata rilevata utilizzando soltanto un numero piccolo di soggetti) e, secondo, che la stratificazione dei casi (tra la forma attiva o latente della TB) potrebbe fornire una maggiore potenza allo studio. Oltre ad A625C, non è stata rilevata la presenza di nessuno degli SNPs mostrati nella sequenza di riferimento. Per esplorare il ruolo di A625C, sono state allineate 11 diverse sequenze del gene di MyD88 appartenenti a diverse specie per studiarne la conservazione. Il basso livello di conservazione suggerisce che il sito polimorfico A625C non è sotto stringente selezione. Analizzando la sequenza dell’introne 1 con SCOPE sono stati evidenziati 4 motivi super-rappresentati nel genoma bovino, i quali includono i sito polimorfico. Questa evidenza potrebbe indicare un possibile ruolo regolatorio di A625C. Questi dati costituiscono un idoneo substrato per ulteriori future investigazioni. L’eterozigosi ad MyD88 e la resistenza alla tubercolosi attiva bovina Per la seconda fase dello studio è stato utilizzato un numero più ampio di campioni: 300 controlli, 150 casi con ATI e 150 casi con LTI, differenti da quelli della prima fase. I casi con ATI non sono in equilibrio Hardy-Weinberg (χ2=4.4). Quando il test è stato ripetuto con i casi LTI, sia casi che controlli sono in equilibrio (χ2controls =0.9; χ2cases = 0.3). I dati suggeriscono un’associazione tra A625C e la ATI, ma non tra A625C e la LTI. Primo, il più stringente test esatto di Fisher mostra che l’eterozigosità (AC status) è fortemente associata con la resistenza alla ATI (OR 0.19, P=6.0x10-12); secondo, l’associazione resta forte anche quando entrambe le classi omozigote (AA e CC) vengono unite (OR 0.22, P=1.8x10-10); terzo, il sito A625C non ha influenzato la predisposizione alla LTI (OR 0.83, P=0.36 e 0.40). La regressione logistica binomiale ha supportato queste conclusioni. L’eterozigosi ad MyD88 e l’infiammazione TNF-α, IFN-ɣ e NOS influenzano profondamente la tubercolosi (Scanga, Bafica et al. 2004). È anche conosciuto che alti o bassi livelli di infiammazione hanno un impatto negativo sulla malattia (Glickman and Jacobs 2001, Doherty and Arditi 2004, Fremond, Yeremeev et al. 2004). Così, se l’eterozigote ad MyD88 mostrasse un livello intermedio di citochine rispetto a quello degli omozigoti, l’associazione tra A625C e la resistenza al Mycobacterium bovis acquisterebbe una fortissima plausibilità biologica. Per validare questa ipotesi sono stati misurati i livelli di mRNA TNF-α, IFN-ɣ e NOS in campioni di polmoni di soggetti con differente genotipo (AA, AC, CC) e status (controlli o animali con ATI o LTI) (6 classi; 5 animali/classe). I livelli di espressione dei soggetti con ATI o LTI sono stati comparati con quelli dei soggetti di controlli aventi lo stesso genotipo. Portatori dell’eterozigosi hanno espresso livelli di TNF-α, IFN-ɣ e NOS significativamente inferiori a quelli espressi dagli omozigoti AA. Al contrario, gli eterozigoti mostrano livelli solo leggermente superiori a quelli espressi dagli omozigoti CC, in questo caso, la differenza non ha raggiunto la significatività statistica. Presi insieme questi dati, supportano la conclusione che un’ottimale risposta infiammatoria è associata con il fenotipo di A625C. Discussione e conclusioni Il presente studio ha dimostrato che nei bovini, animali eterozigoti al sito polimorfico MyD88 presentano un rischio ridotto di circa 5 volte di ATI (OR 0.19, P=6.0x10-12). Tuttavia, la riduzione del rischio non si estende agli animali con LTI (OR 0.83, P=0.36 e 0.40). L’eterozigosi ad A625C è associato con livelli intermedi di TNF-α, IFN-ɣ e NOS. Lo studio ha anche mostrato differenze nell’espressione di mRNA delle citochine tra animali aventi lo stesso genotipo, ma con tubercolosi acuta o latente. La differenza è particolarmente evidente negli animali AA. Purtroppo non possiamo attribuire questi diversi livelli di espressione al patogeno o all’ospite, però i livelli di citochine rappresentano dei potenziali markers per la riattivazione della malattia. Il polimorfismo A625C è locato nell’introne 1 del gene MyD88, questo aggiunge evidenza che regioni non codificanti possono influenzare l’espressione genica. Non è sorprendente che questo accada nel caso dell’infiammazione, la quale ha bisogno di essere soggetta ad una fine e complessa regolazione. Nei bovini, l’esposizione ambientale ai micobatteri, che si verificano nella maggioranza dei soggetti, interferisce con la diagnosi della TB attraverso i TST o IFN-ɣ assay (Hope, Thom et al. 2005). La disponibilità dei reagenti, il tempo di incubazione, ed i livelli di cut-off possono influenzare la specificità e la sensibilità di questi assay (Pai, Riley et al. 2004). Il test batteriologico post-mortem resta, ad oggi, ancora il “gold standard” per le diagnosi di avvenuta infezione (Thacker, Harris et al. 2011). La tubercolosi è influenzata da molti geni che interagiscono tra di loro (Chang, Linderman et al. 2008) e con l’ambiente (Schurr 2007). La presenza del micobatterio è necessaria, ma non sufficiente ad acquisire la malattia, come mostrato dai soggetti di controllo (Diamond 1987). Fattori ambientali (clima, densità dell’allevamento, movimenti del bestiame etc.) sono conosciuti come fattori che promuovono la tubercolosi (Neill, Skuce et al. 2005). Perfino forti effetti genetici sul micobatterio possono essere mancati se non si prendono in considerazione gli effetti ambientali (Schurr 2007). Considerevoli OR e P value (OR = 0.19; P= 6.0x10-12) riportati in questo lavoro ci rendono cautamente ottimisti riguardo la possibilità di approcciare in modo corretto l’analisi genetica di questa complessa malattia. I casi sono stati resi omogenei (ATI ed LTI sono stati analizzati separatamente), i “confounders” ambientali sono stati o esclusi (sesso e razza) o “randomized” (età). Ancor più importante è che i controlli provengono dallo stesso allevamento dei casi e restano tuttavia “liberi” dall’infezione (negativi alla PCR e test batteriologico) nonostante abbiano avuto la stessa probabilità di infettarsi dei casi. Spesso la stratificazione della popolazione è presa in considerazione come responsabile dei falsi-positivi ottenuti dagli studi di associazione, ma raramente è stata dimostrata essere colpevole (Risch 2000, Colhoun, McKeigue et al. 2003). Studi umani hanno mostrato che la stratificazione potrebbe originarsi quando differenti etnie sono mescolate (Healy 2006). Nel presente studio è stata studiata una sola razza. Ulteriormente, gli stessi risultati provenienti da due campioni di popolazioni indipendenti offrono una prova considerevolmente convincente che non sia intervenuta alcuna stratificazione. Gli studi di associazione genetica sono caratterizzati da un alto tasso di risultati falsi-positivi (Risch 2000). Questa conclusione è spesso dovuta alla selezione di un gene candidato senza una relazione funzionale con la malattia (Lander and Schork 1994, Risch 2000). Nel presente studio, MyD88 è stato selezionato sulla base di un largo numero di evidenze sperimentali che mostrano, almeno nel topo, l’importanza di questo gene nel “signaling” a valle della rilevazione di componenti del micobatterio e dell’induzione degli effettori della risposta immunitaria innata da parte delle cellule dell’ospite (Doherty and Arditi 2004, Fremond, Yeremeev et al. 2004). In conclusione, l'elevata rilevanza biologica del gene da studiare, la scelta accurata dei criteri diagnostici, e la randomizzazione dei “confounders” ambientali, sono stati tutti attentamente tenuti in grandissima considerazione durante questo cammino nel complesso campo degli studi di associazione. Tuttavia, poiché l'associazione viene descritta per la prima volta, i risultati di questo studio sono da considerarsi come preliminari. Infine, il test qui utilizzato per distinguere tra malattia attiva e latente potrebbe potenzialmente essere esteso alla verifica periodica dei capi di bestiame per la tubercolosi. Il conteggio dei micobatteri dormienti risvegliato da RpfB in

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